Криомикроскопия
Замораживание образца
При электронной криомикроскопии образец быстро охлаждают и исследуют при температуре жидкого азота (и даже жидкого гелия). Этот метод улучшает сохранность нативной структуры и значительно снижает радиационное повреждение. Образец может выдержать воздействие большего числа электронов, прежде чем разрушиться, или пока не будет потеряна информация высокого разрешения.
Быстрое замораживание
Цель быстрого замораживания – избежать образования кристаллов льда, которые могли бы повредить образец. Маленький объем образца (несколько микролитров) помещают пипеткой на подложку. Её промокают для удаления излишка жидкости, а затем быстро замораживают. Эту процедуру можно проводить во влажной атмосфере, чтобы избежать испарения воды из образца и повышения в нем концентрации солей.
Быстрое замораживание обычно проводят, погружая сетку в сосуд, переохлаждённый с помощью жидкого азота, этанa или пропанa. Эти вещества имеют высокую теплопроводность, обеспечивая высокую скорость замораживания, так что вода на сетке стеклуется (поскольку у нее нет достаточного времени для кристаллизации), и таким образом остается в аморфном состоянии. Эта процедура схематически изображена на рис. Ж1.12. Сетку затем помещают в жидкий азот для хранения до момента переноса в электронный микроскоп.
Рис. Ж1.12. Схематичное изображение процесса быстрого замораживания
Иммуноэлектронная микроскопия
Антитела (обычно IgG) можно использовать для специфического мечения отдельных эпитопов на поверхности молекулы более крупной структуры. Это возможно благодаря специфической форме молекулы антитела, хорошо видной в рентгеновской кристаллографии (рис. Ж1.14б) и различимой в ТЭМ (рис. Ж1.14в). В этом подходе антитела играют роль «трубки курильщика», позволяющей локализовать место курения и идентифицировать картинку, как индейца, курящего трубку.
Рис. Ж1.14. (а) Использование курительной трубки позволяет распознать в сложной картинке курящего индейца. (б) Рентгеновская структура антитела в Т-образной конформации. (в) ЕМ-изображение антитела в Y-образной конформации. (г) ЭМ-микрофотография локализации 3 конца 16S РНК E. coli. 3 конец располагается в бороздке между выступом и головкой субъединицы (Shatsky et al., 1979)
Применение золотых кластеров
Атомы золота хорошо поглощают и рассеивают электроны и поэтому легко различимы в просвечивающей ЭМ. Мечение антител золотом является подходящим методом для локализации отдельных компонент сложных биологических образцов там, где структура антитела сама по себе плохо видна. Кластеры золота могут быть конъюгированы с первичными антителами для одностадийной идентификации эпитопов, либо с вторичными антителами (последнее время чаще используется слово «эпитоп» вместо «антигенная детерминанта»). В общем случае (наиболее распространенном) используется двухступенчатая система: антитела против соответствующего эпитопа образца (первичные), а затем – меченные золотом антитела против первичных антител (вторичные) (Рис. Ж1.15). Следует обратить внимание на то, что линейное «разрешение» во втором случае существенно хуже (2 антитела 15 нм каждое плюс размер золотой частицы).
Рис. Ж1.15. Двухступенчатая схема применения антител. На поверхности тонкого слоя располагаются эпитопы, узнающиеся первичными антителами. Вторичные антитела мечены золотом
Препараты меченных золотом вторичных антител сегодня доступны. Золотые частицы могут быть разного размера (например, 3, 6 и 12 нм) с очень маленьким разбросом по размеру; соответственно возможна одновременная локализация нескольких разных эпитопов (на практике – не более трех). На рис. Ж1.16 показан пример применения двухступенчатой техники к вирусу простого герпеса. Отметим, что кластеры золота обнаруживаются в единственной вершине капсиды.
Рис. Ж1.16 Электронная микрофотография вируса простого герпеса (HSV-1) после обработки антителами, специфичными к портальному белку pUL6, после которой следовала обработка вторичными антителами, меченными золотым кластером. Метка имеет размер 100 нм (Newcomb et al., 2001)