Передача информации от образца к изображению
Главное различие между формированием изображения в рентгеновском дифрактометре и в электронном микроскопе состоит в том, что в последнем случае изображение можно наблюдать непосредственно глазом без необходимости расчета фаз и фурье-анализа. В этом смысле электронный микроскоп ближе к оптическому «собрату».
Распространение электронной волны в микроскопе
По мере движения электронных волн вдоль микроскопа и сквозь образец к регистрирующему устройству, их амплитуда изменяется на разных участках распространения. При описании движения таких волн допускается, что их распространение происходит вдоль оси z.
Падающая на образец электронная волна τпад в процессе распространения в образце изменяется. Покидая образец, рассеянные электроны формируют исходящую волну τвых которая содержит информацию о проекции образца вдоль оси z.
Прошедшую волну можно представить как сдвинутую по фазе падающую волну.
В электронной микроскопии биологических макромолекул образец может рассматриваться как слабый фазосдвигающий объект, поскольку рассеяние в нем испытывает лишь незначительное число электронов.
Поскольку, тем не менее, даже в тонких биологических образцах происходит некоторое поглощение, надо учитывать еще и амплитудную составляющую.
Электронные микроскопы
Просвечивающие и сканирующие микроскопы
В просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ) изображение формируется за счет интерференции между электронами, прошедшими через образец (и взаимодействовавшими с ним) и теми, что не испытали такого взаимодействия. Это приводит к возникновению фазово-контрастного изображения.
Рис. Ж1.4. Схематическое изображение светового микроскопа, просвечивающего и сканирующего электронных микроскопов.
Система получения изображения в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) принципиально другая по сравнению с ПЭМ. Изображение в СЭМ формируется вторичными электронами, генерируемыми неупругим рассеянием от поверхности образца или первичными электронами, которые отражаются или рассеиваются в обратном направлении. СЭМ часто снабжают рентгеновскими детекторами, поскольку наряду с испусканием вторичных электронов возникает и рентгеновское излучение со спектром, характерным для химических элементов, присутствующих в сканируемой области образца. В растровом электронном микроскопе (РЭМ) пучок электронов (зонд) сканирует образец примерно также как в СЭМ, записывая изображение в виде растра. При этом разрешение зависит в основном от размера зонда. Современные РЭМ дают разрешение 0.1 мкм и лучше.
Системы регистрации изображения
Фотопленка, электронно-чувствительные пластины и цифровые камеры
Электронно-микроскопические изображения обычно регистрируют на фотопленках, которые являются эффективной записывающей средой для электронов. Оптическая плотность плёнки на определенном участке (линейная область на рис. Ж1.7.) пропорциональна количеству попавших электронов. Область линейности называется областью динамического разрешения плёнки. Она составляет примерно 20 уровней серого на лучших сортах изделия. Только эта область может быть использована для регистрации ЭМ- изображения.
Рис. Ж.1.7. Зависимость оптической плотности почернения от экспозиции (дозы электронов)
Главное достоинство фотопленки – её дешевизна, большое поле изображения и высокое разрешение (~ 10 мкм). Она все еще остается популярной записывающей средой для многих электронных микроскопистов, несмотря на очевидный недостаток – необходимость химического проявления и невозможность работать в реальном масштабе времени.
В настоящее время для записи данных используют также “image-plates” – пластины со специальным слоем, чувствительным к электронам. После экспозиции, изображение с пластины считывается специальным сканнером в цифровом виде. Такие пластины имеют область динамического разрешения на несколько порядков больше, чем фотоплёнка, и используются для записи дифрактограм. Её недостатком является худшее разрешение (~ 50 мкм) и дороговизна.
В связи с растущей необходимостью иметь изображение в цифровом виде современные ЭМ оборудованы цифровыми камерами. Сегодня такие аппараты позволяют регистрировать изображения в широком диапазоне динамического разрешения (64000 уровней серого) и с достаточным линейным разрешением. Их преимущество заключается в нескольких важных возможностях: анализа «живого» изображения непосредственно в микроскопе, дистанционной записи и анализа изображений, автоматизации (например, автоматическая юстировка микроскопа), быстрота работы - изображения готовы для исследования сразу. Цифровые камеры облегчают процесс фокусирования. Всё это вместе, существенно ускоряет процесс анализа образцов.
Оцифровка изображения
Для компьютерной обработки фотографические изображения должны быть оцифрованы. Этот процесс никогда не бывает идеальным и всегда сопровождается потерями информации. Поэтому имеет смысл использовать для регистрации цифровые камеры или “image-plates”.
Следует учитывать, что для любого цифрового изображения величина шага дискретизации не должна быть меньше половины желаемого конечного разрешения. На практике используют более мелкий шаг (пиксель в 1/3 – 1/4 от разрешения). Уровень серого также должен быть переведен в цифровую форму. Экспозиция на плёнке должна быть таковой чтобы оптическая плотность находилась в линейном диапазоне динамического разрешения плёнки. Цифровые камеры и “image-plates” имеют настолько широкий диапазон динамического разрешения, что интенсивность пикселей практически всегда лежит в линейной области, т.е. пропорциональна дозе электронов. Современные кластеры компьютеров позволяют манипулировать колоссальными объёмами данных, что было невозможно 10 лет назад. К примеру, для 3-х мерной реконструкции используют кластеры, состоящие из тысяч компьютеров. При этом одновременно анализируются сотни тысяч частиц.
приготовление образцов