- •Волновые свойства электронов
- •Взаимодействие электронов с веществом
- •Принципиальная схема микроскопа
- •Электромагнитные линзы
- •Передача информации от образца к изображению
- •Просвечивающие и сканирующие микроскопы
- •Системы регистрации изображения
- •Подложки
- •Тонкие срезы
- •Контрастирование
- •Криомикроскопия
- •Иммуноэлектронная микроскопия
- •Применение золотых кластеров
- •II. Микроскопия силового поля
- •Принципы сканируюшей туннельной и атомно-силовой микроскопии
- •Атомно силовой микроскоп
- •Способы получения изображения
- •Основной принцип работы асм
- •Визуализация биологических структур
- •Подложки и приготовление образцов
- •III. Флуоресцентная микроскопия
- •Стандартный флуоресцентный микроскоп
- •Двух- и трехфотонное возбуждение
Принципиальная схема микроскопа
Схематическая диаграмма электронного микроскопа в режиме дифракции и в режиме изображения представлена на рис. Ж1.2. Падающий пучок электронов освещает образец. Рассеянные и не рассеянные электроны собираются линзой объектива и образуют сначала дифракционную картину, а затем увеличенное изображение образца. Для простоты на рисунке показана одна линза; на самом деле их несколько (обычно 5 или 6), что позволяет получать промежуточные значения увеличения изображения. На практике оно в точке фокуса мало контрастно и для увеличения последнего изображение записывается в недофокусированном или перефокусированном режиме. И, наконец; в зоне наблюдения находится цифровая камера «имидж-плэйт» или фотопластинка.
Рис. Ж1.2. Схематическая диаграмма электронного микроскопа в режиме дифракции и в режиме изображения
Электромагнитные линзы
В электронной микроскопии для управления движением электронов используются особым образом сформированные магнитные поля. Как стеклянная линза фокусирует пучок света, так и электромагнитные линзы фокусируют электронные пучки. Магнитные линзы страдают теми же недостатками, что и оптические. Наиболее существенные из них: хроматическая и сферическая аберрации и астигматизм.
Хроматическая аберрация возникает по двум причинам. Во-первых, когда электроны с разными энергиями попадают на линзу. При этом высокоэнергетические электроны фокусируются дальше от линзы, чем низкоэнергетические; разница в 1-2 еV при использовании термоионного источника уже будет источником хроматических дефектов. Во-вторых, электроны, неупруго рассеянные образцом, имеют более низкие энергии, чем прошедшие без взаимодействия. Поэтому чем толще образец, тем больше вклад хроматических аберраций. Их вклад может быть минимизирован высокой стабилизацией высоковольтных источников питания, применением источников с полевой эмиссией, которые дают монохроматические электронные пучки, и использованием тонких образцов.
Сферическая аберрация проявляется в том, что сила линзы увеличивается по мере удаления от оси микроскопа, так что электроны, рассеянные под большими углами, и электроны, движущиеся вблизи оси, фокусируются в разных положениях. В результате лучи, исходящие от точечного объекта, расходятся в плоскости изображения в некотором радиусе.
Главная особенность магнитных линз состоит в том, что они всегда собирающие и, следовательно, для них невозможно компенсировать сферическую аберрацию путем комбинирования собирающих и рассеивающих линз, как это делается в оптическом микроскопе. Сферическая аберрация не может быть скорректирована и является одним из главных препятствий для получения высокого разрешения.
Разрешение, длина волны и максимальный угол рассеяния есть величины взаимосвязанные. Угловая апертура линзы (2α), т.е. угол между двумя наиболее сильно расходящимися лучами, которые могут пройти через линзу и участвовать в формировании изображения объекта, в соответствии с этим определяет максимальное разрешение линзы, d:
(Ж1.6)
Поскольку λe очень мало, часто удобно считать, что данные ЭМ не испытывают дифракционного ограничения. Однако при наличии сферической аберрации предел разрешения ухудшается, поскольку лучи, проходящие через линзу под большими углами, фокусируются в более близкой к линзе точке, чем центральный луч. Чтобы уменьшить влияние сферической аберрации, величина α должна быть сделана как можно меньшей, но с другой стороны в соответствии с критерием Аббе (dмин=0.5λ/α), основанном на теории дифракции, для улучшения разрешения значение α должно быть как можно больше. Противоположные требования приводят к оптимальному значению α, даваемому формулой:
(Ж1.7a)
где CS это коэффициент сферической аберрации. Тогда разрешение в терминах геометрической оптики дается выражением:
(Ж1.7б)
При CS = 1 мм максимальное теоретическое разрешение 100 кэВ микроскопа составляет 5 Å. Таким образом, разрешающая способность электронного микроскопа ограничивается в основном сферической аберрацией.
Астигматизм является, в основном, следствием несовершенства (неоднородности) магнитного поля линзы. Его вклад можно минимизировать введением дополнительных внешних магнитов, производящих поле, корректирующее внутренний астигматизм.
В заключение заметим, что электромагнитные линзы имеют относительно короткую фокальную длину. Так, фокальная длина объективной линзы в ТЭМ составляет всего 2 мм и поэтому образец должен находиться очень близко к линзе. В современных микроскопах он помещается непосредственно в магнитном поле линзы.
Отношение сигнал/ шум
Отношение сигнал/шум выражает надежность, с которой структурный элемент изображения можно отличить от фоновых шумов. Обычно считается, что полезный сигнал образуется в результате упругого рассеяния электронов образцом, а шумы – как результат неупругого рассеяния и случайных флуктуаций числа электронов, создающих различные участки изображения. Величина отношения сигнал/шум (S/σ), требуемая для регистрации с определенным контрастом (К) однородного объекта площади А на однородном фоне, дается соотношением Розе:
(Ж1.5)
где контраст определен как (nобъект – nфон)/nобъект и nфон, nобъект – среднее число электронов, отображающих фон и объект, соответственно. Для распознавания деталей изображения достаточно иметь отношение сигнал/шум в районе 5-7. S/σ = 5 соответствует 83-процентному уровню достоверности того, что структурный элемент может быть различен на фоне шумов, в то время как S/σ = 1 соответствует уровню достоверности всего 50%.
Принципы получения изображений
