Подложки и приготовление образцов

В качестве подложек в АСМ, в основном используются две: свежее сколотая слюда и высоко ориентированный графит. Посадка биологических макромолекул на подложку является скорее искусством, чем работой и результаты трудно предсказуемые. В ряде случаев подложки покрываются поли-L-лизином, полиэтиленимидом (английская аббревиатура PEI), аминопропилтриэтокси силананом (английская аббревиатура APTES). Функционализация поверхности должна обеспечить или улучшить адсорбцию молекул или образование ковалентных связей. Требуется также подобрать буфер, pH и ионные условия с тем, чтобы обеспечить максимальную адгезию молекулы к субстрату, когда измерения проводятся в жидкости.

Важную роль в получении хорошего изображения в АСМ играет приготовление образцов. В ряде случаев особого приготовления образцов не требуется (например, при наблюдении поверхности графита). Однако при работе с биологическими образцани, их обычно каким-то образом адсорбируют на подложке. Например, для наблюдения ДНК, её наносят на поверхность слюды, модифицированной ионами двухвалентных металлов.

Хорошее качество изображения молекул получается, когда они погружены в жидкость (обычно воду). Это происходит потому, что в воде заметно снижаются силы взаимодействия между зондом и образцом, а, следовательно, не происходит “залипания”. Наблюдение в водных средах позволяет исследовать процессы in vitro, например, самосборку актиновых филаментов.

Большой интерес представляет собой изучение с помощью атомно-силового микроскопа живых биологических объектов – бактерий, вирусов, клеток. Уже есть работы, в которых напрямую наблюдали динамику того или иного процесса, например, образование микропор в бактериальной стенке при воздействии ионов кальция. Йспользование АСМ также перспективно в медицине, например, для получения экспресс-анализов и диагностики заболеваний.

III. Флуоресцентная микроскопия

С изобретением микроскопа оптика вторглась в различные области науки и в первую очередь в биологию. В течение столетий световая микроскопия использовалась для исследования структуры у клеток и тканей. Такая информация полезна для определения подобия элементов у клеточных структур. Ограничение в разрешении у световых микроскопов определяется критериями Релея. В соответствии с этими критериями, если два объекта не могут наблюдаться как различные структуры, то они могут оцениваться как совпадающие в пространстве. Совпадение можно представить как большое сходство, достаточное для того, чтобы ассоциация молекул была возможна, хотя световая микроскопия и не имеет достаточного разрешения, чтобы определить, действительно ли сходство является эквивалентным молекулярному взаимодействию.

Флуоресцентная микроскопия обладает рядом преимуществ по сравнению с обычной световой микроскопией. Только с её помощью, используя технику переноса энергии, можно определить, находятся ли две молекулы на расстоянии между 20 и 100 Å одна от другой, т. е. достаточно близком для того, чтобы происходило взаимодействие между ними.

В ближайшем будущем можно ожидать, что большинство типов биологической активности можно будет наблюдать при помощи микроскопа. Оптическая техника, которая преодолевает дифракционные барьеры, с целью повышения пространственного разрешения в микроскопии дальнего поля, несомненно будет развита дальше для того, чтобы определять активности во внутриклеточных структурах, таких как аппарат Гольджи, визикулы и трубочки, митохондриальные компартменты. Для достижения этой цели используется усовершенствованное оборудование на базе световой микроскопии в затухающих волнах и двухимпульсной стимулированной микроскопии, которая сегодня претендует на разрешение в 70 нм. Эти две техники дальнего поля, преодолевающие дифракционный барьер, будучи объединены с флуоресцентной микроскопией, получающей изображения в реальном времени жизни, открывают новые горизонты для исследования реакций между белками в компартментах клетки. Несомненно, что эти и другие виды микроскопии будут играть важную роль в пост-геномной эре, где функция гена будет выявляться в его натуральном окружении: в клетке.