лекция 16. Визуализация биологических объектов
I. Электронная микроскопия
Развитие электронной микроскопии открыло новые перспективы для структурных исследований широкого круга макромолекулярных комплексов с разрешением порядка нанометра и лучше. Оказалось возможным исследовать объекты самой различной формы, от асимметричных частиц и спиралевидных нитей (одномерных кристаллов) до двумерных кристаллов и даже трехмерных кристаллов.
Возможности ЭМ ограничиваются в основном радиационным повреждением объектов изучения, приводящим к низкому значению отношения сигнал/шум, что определяет как разрешение, так и минимальные размеры изучаемых комплексов. В настоящее время реконструкции частиц имеют разрешение в нанометровом диапазоне, хотя для двумерных кристаллов получены реконструкции с разрешением близким к атомарному. Непрерывные инновации в технике ЭМ, а именно: появление микроскопов, работающих при нескольких сотнях киловольт с высоко когерентными источниками электронов, охлаждение образцов до гелиевых температур, работа в глубоком вакууме – приводят к определению структуры одиночных биологических молекул все с бóльшим пространственным разрешением. ЕМ- микроскопия развивается очень быстрыми темпами и имеет хороший шанс стать серьезным конкурентом рентгеноструктурному анализу, сохраняя различия в требуемых концентрациях исследуемого материала в многих порядках.
Волновые свойства электронов
Электроны, подобно фотонам и нейтронам, обладают двойственной способностью вести себя – и как волна и как частица. Электронная микроскопия базируется на их волновых свойствах. Соотношение де Бройля применимо к электронам и связывает между собой импульс и длину волны через постоянную Планка h:
h = λep (Ж1.1)
где λe это длина волны электрона, а p его импульс.
Электроны можно также рассматривать как заряженные частицы, вследствие этого электромагнитные поля влияют на их движение. Частица заряда q и массы m, помещенная в электрическое поле, ускоряется, и, пройдя разность электрических потенциалов V (в вольтах) приобретает кинетическую энергию:
(Ж1.2)
где p – это приобретенный импульс. Поскольку электрон имеет заряд (– е), его импульс можно записать как:
(Ж1.3)
где масса электрона me составляет 9.1 10-28 г, или 9.1 10-31 кг.
Электронный микроскоп позволяет исследовать объекты в широком диапазоне линейных размеров, перекрывающемся с оптической микроскопией (Рис. Ж1.1). Длина волны электрона и связанное с ним разрешение – это параметр, определяемый ускоряющим напряжением. Длину волны определяют следующим образом:
(Ж1.4)
Таким образом, в электронном микроскопе с энергией 100 кэВ длина волны электронов составляет 0,037 Å. Это на пять порядков меньше, чем длины волн видимого света и почти на два порядка короче длины волны рентгеновских лучей. Отсюда можно было бы ожидать, что электронный микроскоп будет давать изображение со значительно бóльшим разрешением, чем дифракция рентгеновских лучей. Однако этого не происходит по ряду причин, главная из которых состоит в трудности создания линз, способныx фокусировать электроны без сферических аберраций.
Рис. Ж1.1. Диапазоны разрешающей способности оптического и электронного микроскопов. Обратите внимание, что разрешающая способность оптического микроскопа в режиме дифракции дальнего поля составляет ½ длины волны (~ 250 нм)
Отметим два принципиальных отличия рассеяния рентгеновских лучей от рассеяния электронов. Во-первых, сечение рассеяния для электронов в 105 раз больше чем для рентгеновских лучей. Это означает; что измеряемый сигнал рассеяния электронов может быть получен от образца, толщиной от 1 до 10 нм, тогда как аналогичный сигнал рассеяния рентгеновских лучей требует кристалла толщиной от 50 до 500 мкм. Во-вторых, электроны легко фокусируются электромагнитными линзами. Следствие этого является тот факт, что простым «переключением» электронный микроскоп может переходить из дифракционного режима в режим двумерного изображения. Напоминаем, что рентгеновских линз не существует и поэтому в рассеянии рентгеновских лучей возможен только дифракционный режим.
Взаимодействие электронов с веществом
Взаимодействие электронов с веществом можно разделить на четыре отдельных процесса: отсутствие взаимодействия, упругое и неупругое рассеяние и радиационные повреждения.
Отсутствие взаимодействия
Свыше 90% падающих электронов проходит прямолинейно через образец и совершенно с ним не взаимодействует.
Упругое рассеяние
Падающий электрон рассеивается экранированным кулоновским потециалом существующим между положительно заряженными ядрами атомов и налетающим отрицательно заряженным электроном. Поскольку масса протона в 2000 раз больше массы электрона, последний рассеивается без заметной потери энергии. Такие упруго рассеянные электроны играют основную роль в формировании изображения.
Сечение упругого рассеяния не связано прямо с числом электронов в атоме, как это имеет место в рассеянии рентгеновских лучей. Оно определяется электрическим потенциалом внутри атома, который зависит не только от заряда ядра, но и от размера окружающего ядро электронного облака. Поэтому фактор рассеяния электрона очень чувствителен к эффективному радиусу внешней валентной электронной оболочки и зависит от типа химических связей.
Неупругое рассеяние
Между быстро налетающим электроном и медленно движущимися электронами атомов образца может происходить обмен энергии. Это приводит к тому, что рассеянный электрон продолжая движение теряет часть энергии и его длина волны изменяется. Электроны с разными длинами волн фокусируются в разных местах, что вызывает размывание изображения, известное как хроматическая аберрация. Для её уменьшения требуются очень тонкие образцы. Как и неупруго рассеянные рентгеновские лучи и нейтроны, неупруго рассеянные электроны содержат потенциальную информацию о динамике рассеивателя.
Радиационные повреждения
При неупругом рассеянии энергия падающих электронов передается образцу. При этом из образца могут выбиваться вторичные электроны, с энергиями в 5-10 раз превышающими энергию валентных связей. Результатом такого процесса является радиационное повреждение, резко снижающее количество доступной структурной информации. Это явление ограничивает получаемое разрешение.
Радиационное повреждение приводит к парадоксальной ситуации: для распознавания деталей молекулы требуется относительно сильный поток электронов, а для предохранения структуры от разрушения пучком необходим слабый поток. Применение усилителей изображения, использование защитных реагентов, переход к более высоким напряжениям и измерение при низких температурах позволяют увеличить время жизни образца в несколько раз.
Заметим, что эффекты радиационного повреждения под действием электронным пучком практически идентичны эффектам, наблюдаемым при использовании рентгеновского и нейтронного рассеяния.