Многомерный, гомо- и гетероядерный ямр
Многомерный гомоядерный ЯМР
По аналогии с координатными осями 2D-ЯМР, в 3D- и 4D-ЯМР-спектрах они соответствуют третьей и четвертой частотной области.
Напоминаем, что все 2D-эксперименты построены по одной основной схеме: за подготовительным импульсом (P) следует период эволюции (E(t1)) во время которого спины помечаются в соответствие с их химическим сдвигом, за ним идет период смешивания (M), в течение которого спины коррелируют друг с другом, и наконец период детектирования (D(t2)).
3D-импульсная схема состоит из двух 2D-импульсных последовательностей, с исключенным периодом детектирования первой и подготовительным импульсом второй (Рис. K2.33). Два периода эволюции t1 и t2 выбираются независимо друг от друга, за ними следует период детектирования t3. Дальнейшее расширение эксперимента в четвертую частотную область легко осуществляется путем комбинирования трех 2D-схем, исключая подготовительные импульсы второго и третьего экспериментов и период детектирования первого и второго.
Первые 3D-эксперименты были выполнены на 1H-гомоядерных белках. Несмотря на элегантность метода пределом таких 3D-экспериментов являются белки с молекулярной массой около 10 кДа, поскольку число пиков (протонов) увеличивается в ~5 раз из-за переноса кросс-пиков NOESY на все протоны спиновой системы.
Спектроскопия Оптимизированной Поперечной Релаксации (TROSY)
В течение последних 20 лет максимально доступное магнитное поле в ЯМР-экспериментах повышалось с шагом, соответствующим резонансным протонным частотам 400, 500, 600, 750, 800, а теперь уже 900 МГц. Каждый из этих шагов открывал перед ЯМР-методом новые возможности в структурной биологии из-за увеличения чувствительности и более полного разделения пиков. Однако, для гетероядерных экспериментов эти преимущества частично нивелируются зависящим от поля уширением линии вследствие увеличения скорости поперечной релаксации. Чтобы преодолеть это ограничение ученым российской школы К. Первушиным (К. Pervushin), из лаборатории Вютриха была предложена схема TROSY.
Последовательность импульсов TROSY для 2D-15N-1H-корреляционной спектроскопии показана на рис. K2.36.
Рис. К2.36 Основная последовательность импульсов в двумерной 15N-1H-корреляционной спектроскопии
В этом эксперименте сначала создают протонную намагниченность, которая затем переносится на ядра 15N через элемент переноса поляризации (INEPT, см. К2.3.3). После «частотного мечения» 15N-намагниченность в течение периода эволюции t1 возвращается на 1H через элемент обратного переноса поляризации, и затем детектируется на 1H в течение t2. Поперечная релаксация (раздел K2.3) происходит в многомерных ЯМР-экспериментах, т.е. во время периодов переноса поляризации, а также в течение периодов частотного мечения. Скорость поперечной ядерной спиновой релаксации возрастает с ростом молекулярной массы и имеет наибольшее влияние на максимально допустимый размер изучаемых с помощью ЯМР макромолекулярных структур в растворе.
Технически, подход TROSY реализуется следующим образом. В гетероядерных системах двух спинов, таких как 15N-1H и 13С-1H, ЯМР-сигнал каждого ядра расщепляется на два компонента через скалярное спин-спиновое взаимодействие. Поэтому в двумерных корреляционных экспериментах наблюдается четкая структура из четырех линий. При использовании техники TROSY мультиплетная структура не рассогласовывается и сохраняется только самая узкая и наиболее медленно релаксирующая полоса каждого мультиплета.
Осуществление [15N-1H]-TROSY в эксперименте по тройному резонансу дает в несколько раз большую чувствительность для 2H/13C/15N-меченых белков и примерно двукратную чувствительность для 1H/13C/15N-меченых белков. С помощью TROSY в настоящее время можно получать трехмерные структуры белков с молекулярной массой, близкой к 100 кДа.
В заключение заметим, что реализация таких экспериментов на практике требует огромной подготовительной работы по селективному мечению белков и немалых капиталовложений.