Спектроскопия с использованием ядерного эффектa Оверхаузера (noesy)
Последовательность импульсов NOESY сходна с таковой в COSY, но отличается дополнительным третьим 90o-м импульсом (Рис. K2.31). Результирующая последовательность выглядит следующим образом:
установление равновесия – 90o ↓ t1↓ 90o – τсмеш – 90o – ↓ t2 - детектирование.
Рис. К2.31. Вверху показана последовательность импульсов в двумерном NOESY. Внизу показан контурный график схематичного двумерного NOE-спектра. Из пяти резонансных линий A-E только три пары близки в пространствe: A и C, B и D, B и E (Kumar et al, 1980)
Как и в COSY первая часть последовательности состоит из времени для установления равновесия и начального 90o-го импульса. После этого вектор z-намагниченности находится в плоскости xy. В течение варьируемого периода развития t1 ядра приобретают химические сдвиги, соответствующие их микроокружению. Второй 90o-й импульс поворачивает часть намагниченности обратно к оси z. В течение интервала τсмеш (который обычно постоянен) продольной намагниченности дают отрелаксировать. Это приводит к смешиванию намагниченности ядер, которые связаны механизмом дипольной релаксации, коррелируя таким образом их химические сдвиги. Третий 90o–й импульс сообщается системе чтобы повернуть векторы обратно к плоскости xy, где они детектируются в течение периода t2.
Общие черты 2D-NOE-спектра отмечены в нижней части рис. K2.31. Компоненты намагниченности, которые не обмениваются с другими компонентами в период смешивания τсмеш сохраняют свои частоты в течение периодов t1 и t2. Поэтому соответствующие пики в 2D-спектре лежат на диагонали. Обмен намагниченности между двумя компонентами из-за дипольного взаимодействия во время периода смешивания приводит к образованию перекрестных пиков. Из рис. К2.31 видно, что пик A связан диполь-дипольным взаимодействием с пиком C, а пик B – с D и E.
Рис. К2.32 Контурный график протонного двумерного NOESY-спектра BPTI при 360 МГц. Концентрация белка составляла 0.02 М, растворитель 2Н2О, рН 3.8, Т=18оС. Время смешивания равнялось 100 миллисекундам. Полное время накопления – 18 часов. Пунктиром показаны кросс-релаксационные связи для выбранных аминокислот (см. текст). Связанные пики охарактеризованы однобуквенными символами для аминокислот (А= аланин, T = треонин, С = цистеин, Q= глутамин, F = фениналанин, Y = тирозин), положением в аминокислотной последовательности (числа) и типу наблюдаемых протонов. Полосы интенсивных артефактных сигналов простираются от линии воды при 4.85 м.д. параллельно осям ω1 и ω2
2D-NOESY-спектр BPTI показан на рис. K2.32. Он показывает, например, что протон амидной группы Glu 31 сближен с α-протоном Cys 30, так же видно близкое расположение между 3,5-протонами кольца Tyr 23 и α- и метильными протонами Ala 25. Перекрестные пики указывают на то, что пары протонов разделены менее чем 5 Å, тогда как отсутствие пика говорит о бóльшем расстоянии. NOESY-спектр и его качество имеет принципиальное значение для расшифровки трехмерной макромолекулярной структуры с помощью ЯМР.