Корреляционная спектроскопия (cosy)
Корреляционная спектроскопия (COSY) – одна из наиболее простых и полезных техник для различных 2D-ЯМР-экспериментов. На самом деле, COSY был первым описанным 2D-ЯМР-экспериментом. Простейший COSY-эксперимент показан на рис. K2.26. Для получения данных используется последовательность импульсов типа 90o – kt1 – 90o, где k = 0, 1, 2…2n. Эксперимент повторяется для каждого значения k.
Установление равновесия -90o↓ – kt1 –↓ 90o- детектирование
Рис. К2.26 Последовательность импульсов в COSY в графическом (верх) и сжатом (низ) представлении
Рассмотрим два скалярно сопряженных протона A и B. В результате действия простого импульса и регистрации, a также и последующего фурье-преобразования получают ЯМР-спектр, который на рис. K2.27 показан в виде диаграммы.
Рис. 2.27. Фурье-преобразование сигнала, возникающего в результате приложения радиочастотного импульса к двухспиновой системе дает ЯМР-спектр
Обозначим ларморовы частоты спинов A и B и их скалярное сопряжение (J), соответственно, как ωA, ωB, JAB. Спин A прецессирует с ларморовой частотой ωA в течение периода t1, а спин B прецессирует с ларморовой частотой ωB в течение t1, хотя в действительности для каждого спина существуют две частоты (ωA± ½ JAB и ωB ± ½ JAB) вследствие спин-спинового взаимодействия. Теперь рассмотрим результат действия последовательности импульсов изображенных на рис. K2.28. Пусть мы регистрируем данные в течение интервалов t1 и t2. После второго 90o-ного импульса ситуация усложняется. Во-первых, второй импульс не повлияет на часть спинов, т.е. они будут продолжать прецессировать с частотами ωA и ωB в течение периода t2 – также как и в период t1. Во-вторых, часть намагниченности, связанной со спином A, будет переноситься на спин B в течение времени t2 из-за скалярного взаимодействия JAB. Этот результат – следствие процесса, известного как перенос когерентности. Поэтому, часть спинов A, прецессировавших в течение t1 с частотой ωA, будет прецессировать с частотой ωB во время t2. В аналогичной манере, часть спинов, прецессировавших с частотой ωB во время t1, теперь прецессирует с частотой ωA во время t2. Далее: поскольку мы наблюдаем ЯМР-спектр по отношению к двум временным периодам, необходимо применить фурье-преобразование для наблюдения описанных частотных компонентов. Это значит, что мы можем представить спектр в двух частотных измерениях на плоскости. Такой график для системы двух спинов показан на рис. K2.28.
Рис. К2.28. Схематическая иллюстрация контурного графика 1Н-1Н-COSY-спектра для двух взаимодействующих спинов. Черными кружками отмечены диагональные пики, а светлыми недиагональные или перекрестные-пики. Пунктирной линией показано, как перекрестные-пики коррелируют с диагональными пиками, полученными из скалярно взаимодействующих спинов
Реальный спектр, полученный для 2,3-дибромтиофена с помощью последовательности импульсов, похожей на ту, что изображена на рис. K2.26, показан на рис K2.29. Можно видеть два типа двумерных пиков. Восемь пиков вокруг диагональной линии (пунктирная прямая на рис. K2.29), пересекающей спектр, есть результат взаимодействия одних и тех же спинов в обоих измерениях (± ½ JAB). Другие восемь пиков за пределами диагональной линии соответствуют взаимодействию между разными спинами (опять же, ± ½ JAB). Последние восемь пиков в этом случае очень важны, поскольку их появление указывает на то, что существует взаимодействие между двумя сближенными ядрами через скалярное сопряжение. Ниже мы увидим, что перекрестные пики широко используются для трехмерной расшифровки сложных спектров белков, даже в тех случаях, когда резонансные линии в одномерном спектре перекрываются.
Рис. К2.29 Двумерный спектр 2,3-дибромтиофена (спиновая система AX), полученный с помощью последовательности импульсов, показанной на рис. К2.26. Справа - его структурная формула. Химическая формула 2,3-дибромтиофена - С4Н2Br2S
Во втором примере на рис. K2.30a показаны одномерный и 2D-COSY –спектры для небольшого белка из 57 аминокислотных остатков ингибитора протеазы K. Отметим, что двумерный спектр белка может быть изображен двумя различными способами. В первом способе, называемым этажерочным (Рис. K2.30б) высоты пиков показываются в третьем измерении, тогда как во втором, называемом контурным, высоты пиков пропорциональны их интенсивности на двумерной плоскости (Рис. K2.30в).
Рис. К2.30. 1H-COSY-спектр D2O-раствора ингибитора K (0.01 M, pD 3.4, 25oC, 360 МГц): (а) одномерный 1H-ЯМР-спектр; (б) этажерочное представление COSY-спектра; (в) контурный график COSY-спектра (Wutrich, 1986)
На диагонали, идущей от верхнего правого угла этажерочного 1H-COSY-спектра (Рис. K2.30б), можно распознать полный одномерный ЯМР-спектр (Рис. K2.30a). Например, высокопольные пики резонансов метильных группы при – 0.9 м.д. имеют координаты (ω1 = - 0.9 м.д., ω2 = - 0.9 м.д.), а самые низкопольные резонансы амидных протонов располагаются при 10.3 м.д. (ω1 = 10.3 м.д., ω2 = 10.3 м.д). Расположение этих перекрестных пиков лучше всего видно на контурном графике (Рис. K2.30в). Спектр симметричен по отношению к диагонали. Используя эмпирическое правило, что перекрестные пики COSY наблюдаются, за некоторым исключением, только между протонами, разделенными тремя или менее ковалентными связями в аминокислотной структуре можно очертить области -NH (Рис. K2.30в, ниже диагонали) между этими протонами в аминокислотах.