Ионизация лазерной десорбцией с поверхности кремния
В противоположность MALDI ионизация лазерной десорбцией с поверхности не содержит матрицы как таковой. Она осуществляется с поверхности твердого кремния и получила название DIOS (английская аббревиатура от Desorption/Ionization on Silicon). Поверхность структурированного кремния, такого, как пористый кремний или кремниевое нановолокно, является полупроводником с большой площадью поверхности и сильно поглощают УФ-излучение в области 340 нм. При применении в масс-спектрометрии с лазерной десорбцией/ионизацией, строение структурированного кремния обеспечивает каркас для накопления молекул растворителя и вещества, а поглощение УФ-излучения обеспечивает передачу энергии лазера исследуемым молекулам. В отличие от других прямых безматричных методов десорбции DIOS позволяет проводить десорбцию/ионизацию с малым разложением исследуемых молекул или вообще без него. Такая ионизация имеет очень высокую чувствительность и позволяет анализировать вещество на уровне всего 800 йоктомолей (480 молекул). Напоминаем, что один йоктомоль равен 10-24 моля. Лазерная десорбция с поверхности кремния схематически представлена на рисунке 7.12.
Рис. 7.12. Лазерная десорбция с поверхности кремния
Ионизация электрораспылением
Серьезную конкуренцию MALDI сегодня составляет метод ионизации, получивший название электрораспыления ЕSI (от английского Electrospray Ionization). Этот метод ионизации часто называют электродинамическим. Ионизация происходит при взаимодействии сильного электростатического поля с поверхностью жидкости на конце капиллярной трубки (рис. 7.13).
Рис. 7.13. Схематическое изображение траекторий ионов от иглы электрораспылителя до детектора масс-спектрометра. Раствор белка, обычно 1-2 мкл с концентрацией 5 мкМ, помещается в очень тонкий капилляр с диаметром примерно 10 мкм. К позолоченной игле прикладывается напряжение в несколько кВ, вызывая электрораспыление маленьких капель. Положительно заряженные капли десольватируются и фокусируются в масс-спектрометре для детектирования
ESI дает возможность получать интактные ионы из молекул образца, находящихся в растворе при атмосферном давлении. Ионы образуются при подаче напряжения в 1-5 кВ к раствору образца, выходящего через капилляр с низкой скоростью. Большой электрический потенциал, приложенный между концом капилляра и противоположным электродом, расположенным на небольшом расстоянии, вызывает превращение жидкости, выходящей из кончика капиллярной трубочки, в аэрозоль, состоящий из заряженных капель. На выходе образуется совокупность микрокапель раствора, обладающих высоким поверхностным зарядом. Пучок заряженных микрокапель, уменьшающихся в размере за счет потери молекул растворителя, движется к противоэлектроду. Достигая критического размера, при котором силы поверхностного натяжения не могут противостоять силам кулоновского отталкивания, капли взрываются с образованием более мелких капель. Этот процесс повторяется несколько раз. В итоге возникают микрокапли, содержащие всего одну заряженную частицу вещества. Раствор испаряется по мере того, как капли перемещаются из области ионизации с атмосферным давлением в вакуумную камеру, где располагается масс-анализатор. Испарению способствует встречный ток осушающего инертного газа, либо нагрев трубки, через которую капли из источника ионов попадают в вакуумную камеру анализатора. Заряд полученных ионов определяется полярностью приложенного к капилляру напряжения.
В исследуемой жидкости должны быть ионы. Для этого обычно добавляют небольшие количества ионных солей или другие соединения, которые могут привести к образованию ионов. Как правило, максимальное число протонов, которое может присоединить пептид или белок в условиях ESI, хорошо коррелирует с количеством основных аминокислот (Арг, Лиз, Гис) с учетом N-концевой аминогруппы, если, конечно, она не ацилирована. Однако важным фактором в этом процессе является еще и доступность этих протон-связывающих участков. Поэтому распределение зарядов зависит от pH, температуры и присутствия денатурирующих агентов в растворе. Такое распределение можно использовать для исследования конформационных изменений в белке.
Например, во время электрораспыления наиболее распространенный ион бычьего цитохрома c несет 10 положительных зарядов при pH 5.2 и 16 зарядов при pH 2.6. Похожий эффект наблюдается при восстановлении дисульфидных связей. Максимум распределения зарядов ионов лизоцима куриного яйца с четырьмя дисульфидными связями находится в области 12 положительных зарядов (12+), но после восстановления при помощи дитиотрейтола этот максимум смещается в область 15+ .
Привлекательным свойством методики ESI является образование молекулярных ионов, несущих множественный заряд, при условии, что данные молекулы могут принимать более одного заряда. Это свойство позволяет детектировать ионы с большой массой в низком диапазоне величин m/z. Сдвиг шкалы делает возможным детектирование тяжелых ионов с высоким разрешением, поскольку разрешение обратно пропорционально отношению m/z. Точность определения молекулярной массы с помощью техники ESI и масс-спектрометрии с фурье-преобразованием достигает примерно 0.001-0.005%. В благоприятных условиях можно разрешать индивидуальные пики изотопов углерода.