Плазменная десорбция
В масс-спектрометрии с плазменной десорбцией PD (английская аббревиатура от Plasma Desorption) образец наносится на металлическую поверхность и бомбардируется осколками ядер радиоактивного изотопа. В этом контексте термин «плазма» означает атомные ядра, лишенные электронов. В результате спонтанного распада ядер возникают две атомные частицы с большой кинетической энергией (80 МэВ), которые летят в противоположных направлениях. Такая энергия позволяет частицам проникать сквозь тонкую металлическую фольгу и ионизировать биологический материал, нанесенный с обратной стороны.
Деление ядра – это дискретное событие, происходящее с частотой (1-5)103 сек-1, результатом которого является поток ионов, пульсирующий с той же частотой. По этой причине в методе целесообразно использовать время-пролётный масс-спектрометр. Измеряя время полета вторичных ионов и зная их энергию и траектории, можно преобразовать время-пролетный спектр иона в масс-спектр. На рисунке 7.9 показаны основные элементы техники MS-PD с время-пролетным масс-анализатором.
Рис. 7.9. Схема метода MS-PD с источником деления ядер и время-пролетным масс-анализатором
Метод MS-PD обладает хорошей чувствительностью для пептидов и относительно небольших белков (7-20 кДа). Для определения молекулярной массы этим методом обычно требуется около 10 пМ материала. Разрешение при этом составляет около 1000. Основным недостатком этого метода является необходимость работы с радиоактивными продуктами распада.
Ионизация лазерной десорбцией при помощи матрицы
При ионизации лазерной десорбцией лазерное излучение очень большой плотности фокусируется на маленьком участке, что приводит к крайне высокой скорости нагрева. В результате формируется локализованный лазерный «факел» испарившихся молекул из адсорбированного материала. Непосредственная ионизация интактных биологических молекул без использования матрицы ограничена молекулярными массами около 1 кДа. Для преодоления этого ограничения используется лазерная десорбция в матрице, получившая название MALDI (от английского Matrix Laser Desorption Ionization) - матриксная лазерно-десорбционная ионизация или лазерная десорбция в матрице.
MALDI отличается от прямой лазерной десорбции использованием специального материала (матрица), смешанного с образцом. С этой точки зрения такая техника ионизации похожа на ту, которая также использует жидкую матрицу для мягкой ионизации. На практике MALDI обеспечивает еще более мягкую ионизацию, чем FAB, что позволяет анализировать большие молекулы с массой вплоть до 1000 кДа при минимальной фрагментации.
Детальные механизмы превращения энергии (десорбция образца и ионизация) до сих пор полностью не выяснены. Общее представление механизма дано на рисунке 7.10. Энергия лазерного луча поглощается хромофором в матрице, которая очень быстро переходит в газовую фазу, унося с собой молекулы образца. Ионизация происходит за счет переноса протона от возбужденных молекул матрицы к молекулам образца, скорее всего еще в твердой фазе, а также через соударения молекул в расширяющемся «факеле».
Рис. 7.10. Схема механизма MALDI с использованием лазера. Капля облучается лучом лазера, при этом матрица поглощает лазерное излучение
Матрица – ключевой компонент техники MALDI. Она действует как поглотитель энергии, увеличивая время жизни образца. Анализируемый материал смешивается с избытком матричного материала, который поглощает лазерное излучение. В качестве такого материала обычно используют ароматические вещества, содержащие функциональные карбоксильные группы. Ароматические кольца матричного материала играют роль хромофора, поглощая лазерное излучение и способствуя переходу его молекул и молекул образца в газообразное состояние. Матрица не только повышает выход ионов образца, но и предотвращает их излишнюю фрагментацию. Самые распространенные матрицы – это производные никотиновых и коричных кислот. Наиболее используемая, – альфа-циано-4-гидроксикоричная кислота (C10H11O3NСООН), – одноосновная карбоновая кислота ароматического ряда природного происхождения.
Для десорбции биологического материала более всего подходят два типа лазеров: инфракрасный, который способен возбуждать колебательные моды, и ультрафиолетовый лазер, возбуждающий электронные моды в ароматических молекулах. Используют импульсы длительностью 100 нсек и меньше для обоих диапазонов волн, поскольку более длительное воздействие излучения сопровождается нагревом, способным привести к пиролитическому разрушению биологических молекул.
Поскольку большинство лазерных источников импульсные, с MALDI чаще всего используют время-пролетные масс-спектрометры с ионно-циклотронным резонансом и фурье-преобразованием (ICR-FT-МS) (Лекция 7). В настоящее время точность измерения массы в благоприятных условиях составляет ± 0.01% (± 1 Да при молекулярной массе 10 кДа).