Разрешающая способность масс-спектрометрии

Способность к разделению масс определяется разрешающей способностью масс-спектрометра. Разрешение R здесь определяется как , где – разность масс двух соседних пиков m и m + с равной интенсивностью. Разрешение, равное 100 000, позволяет отличить ион с массой 100 000 Дa от иона с массой 100 001 Да, т.е. с точностью одной стотысячной. Напомним, что Дальтон (Да) является внесистемной единицей массы, идентичной универсальной атомной единице массы (1/12 часть массы атома углерода С¹²).

Рис. 7.3. Два определения разрешающей способности в масс-спектрометрии (подробности см. в тексте)

Поскольку пики в масс-спектрах имеют вполне определенную ширину и форму, необходимо определить степень перекрывания двух соседних пиков для оценки разрешения. Существует два общепринятых способа определения перекрывания, и необходимо знать, какой из них используется, когда ссылаются на разрешение в реальном масс-спектре (рис. 7.3). Первый – это так называемый критерий 10%-ого перекрывания, когда каждый из двух смежных пиков вносит 5%-ый вклад в область перекрывания. Второй – это критерий «полуширины на половине максимума». Разрешение в этом случае равно массе пика в Да, деленной на ширину в Да, измеренную на половине высоты пика.

Полезно запомнить, что величина разрешения, определенная с помощью критерия полуширины на половине максимума, примерно в два раза больше величины, полученной при использовании критерия 10%-ого перекрывания. Разрешение, равное 1000 при использовании критерия полуширины на половине максимума, примерно равно 2000.

Вид спектра белка при разном разрешении

Ожидаемый вид масс-спектра гипотетического белка, несущего 16 ионов разного заряда представлен на рисунке 7.4. Спектр измерен на разных приборах с разрешением 500, 5000 и 50000. Из рисунка видно, что разрешение играет фундаментальную роль в представлении масс-спектра белка, делая его одним широким пиком при низком разрешении, более узким пиком при среднем разрешении и линейчатым спектром, состоящим из 16 пиков, при высоком.

Рис. 7.4. Масс-спектр гипотетического белка, несущего 16 ионов разного заряда с разрешением 500, 5000 и 50000. Разрешение определено по критерию полуширины на половине максимума

Точность измерения массы

Точность измерения массы определяется как разность между измеренной и расчетной массами иона. Она выражается в процентах от измеренной массы (например, молекулярная масса = 10 000 ± 0.01%) или в долях на миллион (например, молекулярная масса = 10 000 ± 100 миллионных долей). По мере увеличения массы абсолютная ошибка в процентах или в миллионных долях также будет пропорционально увеличиваться.

Обычно для точного измерения массы не требуется максимального разрешения, если наблюдаемый сигнал для данной массы связан только с одним типом молекул. Основным фактором, ограничивающим такую точность для больших биологических макромолекул, является перекрывание пиков. Однако в подходящих условиях, когда ионы образца полностью отделены от фоновых ионов, измерения, сравнимые по точности, могут быть сделаны и при более низком разрешении.

Рис. 7.5. Кластер молекулярных ионов для окисленной β-цепи инсулина (формула C₉₇H₁₅₁N₂₅O₄₆S₄^, расчетная масса 2531,64 Да), показанный с различным разрешением. Асимметрия кластера становится менее очевидной по мере уменьшения разрешения, при этом масса наибольшего пика и средняя масса становятся практически идентичными

Соотношения между моноизотопной, средней массой и массой наибольшего пика показаны на рисунках 7.5 и 7.6 для белков с массами 2500 и 25 000 при различном разрешении. Важным следствием вклада пиков тяжелого изотопа является то, что для пептидов с массой больше чем 2000 Да, пик, соответствующий моноизотопной массе, более не является преобладающим в изотопном кластере (рис. 7.6).

С повышением молекулярной массы самый большой пик сдвигается по отношению к пику моноизотопной массы. При значениях масс выше 8000 Да вклад моноизотопной массы в спектр становится пренебрежительно малым (рис. 7.6). Использование той или иной массы для характеристики образца зависит от массы вещества и разрешающей способности масс-спектрометра.

Рис. 7.6. Молекулярный ионный кластер белка вируса иммунодиффицита человека HIV-p24 (формула C₁₁₂₉H₁₈₀₂N₃₁₆S₁₃), показанный с различным разрешением. Положение моноизотопоной массы обозначено стрелкой