Реакции с высокими константами связывания

Когда значения c превышают 1000, кривые калориметрического титрования теряют свою характерную форму и больше не содержат информацию о константе связывания (рис. 17.5, центральный и правый графики). Это становится существенным ограничением в применении метода ITC для конструирования лекарств, поскольку «лидирующие компоненты» должны иметь наномолярные или даже более высокие значений аффинности (см. об этом ниже). Тем не менее, в рамках метода изотермической калориметрии титрования разработан протокол, позволяющий определять высокие константы связывания с помощью конкуренции лигандов. Для этого производят три титрования раствора белка. В первом определяют термодинамические параметры связывания для слабого лиганда, во втором  для сильного, а в третьем, названным вытесняющим титрованием, белок, заранее связанный с более слабым лигандом, титруется лигандом с высокой аффинностью. Рисунок 17.6 демонстрирует применение данного метода на примере ингибиторов HIV-1 протеазы, которая использовалась с целью создания лекарств против СПИДа.

Энтальпия связывания при взаимодействии ингибитора с HIV-1 протеазой может быть точно измерена с помощью ITC (рис. 17.6, верхняя правая панель, ось y здесь в мкал∙M^-1) в противоположность константе ассоциации ингибитора K_a, которая слишком велика, чтобы ее можно было определить данным методом. Кажущуюся константу связывания K_каж (рис. 17.6, нижняя панель) определяют вытесняющим титрованием в присутствии слабого ингибитора (ацетил-пепстатин) с констаной связывания K_a,w (рис 17.6, верхняя левая панель). Выбор слабого конкурентного ингибитора с энтальпией связывания, имеющей противоположный знак, позволяет увеличить чувствительность эксперимента. Величина K_a может быть определена из величины K_каж с помощью уравнения:

где [X] – концентрация слабого ингибитора, которую можно довести до необходимой величины K_каж. Величины констант аффинности оказались равными: K_a,w=2.4×10⁶M^-1 и K_a=3.1×10¹⁰M^-1.

Рис 17.6. Вытесняющее титрование для определения высоких констант аффинности связывания (см. текст). Эксперименты по исследованию взаимодействия ингибитора с HIV-1 протеазой проводили при 25°C в 10мМ ацетате, pH 5.0, 2% диметилсульфоксида

Конструирование (дизайн) лекарственных препаратов

Знание трехмерных структур ферментов, участвующих в метаболических реакциях при заболеваниях, помогает созданию высокоаффинных ингибиторов, которые могут стать потенциальными фармацевтическими агентами. Чтобы лекарство было пригодным для лечения, его аффинность должна лежать в наномольном диапазоне (константы диссоциации порядка 10^-9 M).

Если описывать кратко, то конструирование лекарственных препаратов включает в себя несколько шагов. После того как выбран целевой белок, ведется комбинаторный поиск из сотен тысяч агентов, которые могут взаимодействовать с его активным сайтом. Многие из них представляют собой природные молекулы, получаемые из растений. Иногда ингибиторы настолько сложны, что трудно представить их структуру. Примером такой структуры может служить таксол (паклитаксел), антимитотический препарат, получаемый из коры тиса.

Перспективные комплексы белок-ингибитор характеризуют различными методами, включая метод ITC, который дает информацию об энергетике связывания. Затем идет химическое моделирование для нахождения структурных вариантов, способных повысить аффинность ингибитора к белку. Такие модифицированные ингибиторы синтезируются и испытываются, затем процесс повторяется до тех пор, пока не будет найден удовлетворительный фармацевтический агент.