Связывание: энтальпия и теплоемкость

Константа пропорциональности в уравнении 17.1 (∆Н) представляет собой изменение энтальпии H на моль связанного лиганда. Величину изменения теплоемкости процесса можно определить повторным титрованием при разных температурах (уравнение 17.2 и рис. 17.4).

(17.2)

Рис. 17.4. Энтальпия связывания и теплоемкости. График энтальпии связывания как функции температуры для взаимодействий белок-ДНК (HMG-фрагмента белка Sox-5 с ДНК-дуплексом из 12 п.o, содержащего сайт узнавания). Теплоемкость связывания дается начальным наклоном линии (‑6 кДж∙моль^-1∙К^-1) при низких температурах

Если количество добавленного лиганда мало по сравнению с аффинностью реакции (см. ниже), можно предполагать, что он будет весь связан и величину изменения энтальпии можно получить из уравнения 17.1. Более того, если константа ассоциации реакции K_a известна из других измерений (таких как флуоресцентное титрование) или поверхностный плазмонный резонанс, то изменение свободной энергии G, а, следовательно, и изменение энтропии S реакции можно рассчитать из величин G и H, используя классическое уравнение 17.3. Тогда термодинамика реакции будет полностью определена:

(17.3)

В зависимости от числа сайтов и других особенностей модели связывания, математическое выражение, которое связывает константы аффинности с величинами уравнения 17.1, может быть достаточно сложным.

Константы аффинности

В самом простом случае, когда белок P имеет один сайт для лиганда L, можно записать:

(17.4)

где P_общ и L_общ – совокупная концентрация белка и лиганда, а квадратные скобки обозначают молярные концентрации. Комбинируя уравнения 17.1 и 17.4, получим

(17.5)

где [L]_j – это концентрация свободного лиганда после j-титрования.

Данный анализ также применим для реакций с числом сайтов более одного с одинаковыми или разными константами связывания. В этом случае уравнение 17.5 принимает более сложный характер и для его решения требуются дополнительные данные, поскольку количество параметров становится велико.

Как мы указывали ранее, из данных титрующей микрокалориметрии можно определить стехиометрию образующегося комплекса. Однако это требует высокой точности в определении концентрации участвующих в реакции компонентов.

В тех случаях, когда энтальпия реакции недостаточно большая для того, чтобы ее можно было измерить во всем диапазоне концентраций лиганда, сама константа может быть определена с помощью серии титрования (рис. 17.5). Для соотнесения константы связывания с условиями эксперимента вводят дополнительный параметр c, равный:

c = K_a[P] (17.6)

Значение c должно быть меньше 1000 для того, чтобы константу K_a можно было определить с помощью калориметрии титрования. На практике данное соотношение устанавливает верхний предел в 10⁸-10⁹ M^-1 для константы связывания (рис. 17.5).

Рис. 17.5. ITC-кривые для различных констант аффинности. Здесь приведены три искусственные кривые для иллюстрации эффектов возрастающей аффинности связывания. Для моделирования были использованы следующие параметры: [P] = 0.05 мМ; [L] = 0.6 мМ; H = -42 кДж∙моль^-1. Величины K_a и c показаны на рисунке, где c = K_a[P]. Aффинность связывания устанавливается только в случае, изображенном на левом графике (c<1000), где величина пиков последовательно уменьшается. Если же аффинность слишком велика для экспериментальных условий (c>1000 (центральный и правый график), тогда можно оценить только ее минимальное значение. Напомним, что микроватты, умноженные на коэффициент 4.2, соответствует

микрокалории в секунду