Изотермическая калориметрия титрования Изотермический калориметр
Изотермическая калориметрия титрования (от английского Isothermal titration calorimetry ITC) обеспечивает полное термодинамическое описание взаимодействия вступающих в реакцию компонентов (обычно два). При таком взаимодействии тепло либо поглощается, либо выделяется в зависимости от характера происходящих реакций. Реакционная ячейка в приборе для изотермической калориметрии титрования имеет объем около 1 мл и содержит один из реагентов. Небольшой объем другого реагента (около 5-10 мкл) впрыскивают в ячейку и перемешивают (рис. 17.1). Калориметр измеряет мощность (в мкДж∙сек-1 или в микроваттах), требуемую для поддержания постоянной разности температур между реакционной и эталонной ячейками. Тепло, поглощенное или выделенное в результате химической реакции, определяется интегрированием кривой компенсационной мощности за время эксперимента.
Рис. 17.1. Схематическое представление изотермического титрующего калориметра, состоящего из двух одинаковых реакционных ячеек. Раствор, содержащий лиганд вводится в реакционный раствор с помощью шприца
При «насыщении» раствора белка лигандом тепловой сигнал становится равным нулю. Измерения теплового профиля при титровании обеспечивает определение константы связывания (Ксв), стехиометрии реакции (n), энтальпии (ΔHизм) и энтропии (ΔSизм). Измерения при разных температурах позволяют вычислить также избыточную теплоемкость (ΔCp,набл) и свободную энергию (ΔG) реакции (рис. 17.2). Измерения такого рода являются комплементарными таковым, полученным с помощью дифференциальной сканирующей микрокалориметрии. В ряде случаев они предпочтительнее в силу простоты измерений.
Рис. 17.2. Общий вид процессов при титровании белка лигандом. Каждая острая линия на рисунке вверху и каждая точка на рисунке внизу соответствует одному впрыскиванию раствора лиганда в раствор белка
Проведение измерений и требование к образцам
Для получения оптимальной изотермы связывания необходимо правильно выбрать
относительные концентрации партнеров для связывания. Концентрация титруемого белка должна быть по крайней мере в 10-30 раз больше, чем ожидаемая константа диссоциации белка Kдис. Если концентрация белка существенно выше, то кривая титрования будет слишком резкой. Молярные концентрации лиганда и белка должны находиться в соотношении около 4:1. Количество лиганда в каждой инъекции должно быть выбрано таким, чтобы после 10-15 инъекций молярное соотношение компонент было равным 1:1.
Хотя современные калориметры обладают низким уровнем шума, однако измерения реакций, сопровождающихся низкими величинами ΔH и высокими величинами ΔS, могут представлять определенную проблему даже при высоких константах связывания. В этих случаях рекомендуется повысить концентрацию (чем выше, тем лучше) и изменить температуру, поскольку ΔH зависит от температуры. Растворы должны быть тщательно отдиализованы и дегазированы. Конкретный пример профиля титрования белка РНКазы циклическим монофосфатом показан на рисунке 17.3. По оси y отложена временная зависимость мощности, требуемая для поддержания постоянной разности температур между измерительной и эталонной ячейками. Каждый пик соответствует одной инъекции, а интеграл мощности (после вычитания фона, вызванного растворением лиганда, механическим эффектом смешивания и т.д.) – теплу, ассоциированному с величиной связывания (qj в уравнении 17.1).
Величина тепла qj, поглощенного или выделенного в результате j-впрыскивания (рис. 17.3), равна:
(17.1)
где V – это объем реакционной ячейки, а Lj,связ – изменение концентрации связанного лиганда после j-инъекции. Таким образом, величина qj пропорциональна количеству лиганда VLj,связ, который связан с белком.
Рис. 17.3. Экспериментальные кривые ITC связывания циклического монофосфата с РНКазой Калориметрическая ячейка объемом 0.6 мл заполнялась раствором белка (68.8 мкМ панкреатической РНКазы, а раствор лиганда (0.5 мМ циклической монофосфатазы) добавлялся в объеме 5 мкл с помощью шприца, который служил также и для перемешивания раствора. а) Мощность, требуемая для поддержания постоянной разности температур между измерительной и эталонной ячейками, выраженная как функция времени. Каждый пик соответствует одному впрыскиванию. б) Интегральный тепловой эффект связывания как функция в каждой точке впрыскивания
Величина пика с каждой последующей инъекцией уменьшается, поскольку все меньше свободного белка остается для связывания. Когда белок насыщен лигандом полностью, высота пика отражает фоновый уровень. График интегральной величины теплового эффекта связывания как функция числа инъекций показан на рисунке 17.3 б.