Кривая плавления двойной спирали днк

Молекулы ДНК в виде двойной спирали – «простая» молекула. Ее простота связана, прежде всего, с тем, что она является линейной молекулой, упорядоченной только в одном направлении (одномерный квазикристалл) – каждая пара оснований имеет только двух соседей. С ростом температуры существование двойной спирали становится невыгодным. Однако, в отличие от гомополимерных комплексов, двойные спирали которых распадаются кооперативно, отдельные участки ДНК, обогащенные разными парами оснований, выплавляются поочередно. В результате в двойной спирали сначала образуются однонитчатые петли, а кульминацией процесса является разделение молекулы ДНК на две развернутые цепи. Энтропия молекулы увеличивается, поскольку каждая цепь приобретает большую конфигурационную свободу (рис. 16.2 а).

Рис. 16.2. а) Схематическая картина плавления канонической ДНК. б) Реальная картина плавления фрагмента ДНК. Кривая записана на дифференциальном сканирующем микрокалориметре MicroCal MC-2. Концентрация 55 мг/мл. Объем ячейки 1.5 мл. Буфер: 5 мМ натрий кокодилат, pH 4.6

Рисунок 16.2 б, на котором показана кривая плавления фрагмента тимусной ДНК теленка длинной 160 пар оснований, подтверждает сказанное – полуширина перехода составляет около 17^оС из-за того, что он является суперпозицией нескольких более узких переходов, наличие которых видно по перегибам и другим деталям на кривой. Эти узкие переходы соответствуют выплавлению отдельных блоков, различающихся по среднему содержанию двух типов пар оснований. Приведем некоторые усредненные параметры, характеризующие плавление структуры ДНК в вышеописанном случае: средняя температура плавления T_пл = 75.5^оC (зависит от состава и ионной силы буфера), полная калориметрическая теплота плавления ΔH_кал = 6.7 ккал на моль пар оснований. Другие термодинамические характеристики, такие как энтальпия Вант-Гоффа не имеют большого смысла, так как процесс плавления не является одностадийным. По грубой оценке кажущийся размер средней кооперативной единицы плавления составляет 7,5 п.о, что существенно меньше по сравнению с модельными структурами ДНК. Отметим, что приведенные параметры следует рассматривать только как ориентировочные средние величины вроде средней температуре по больнице, в то время как параметры плавления кооперативных блоков, включая их размеры, вполне реально могут быть оценены исходя из последовательности пар оснований.

Влияние содержания А-Т и G-C пар

Плавление двойной спирали ДНК хорошо изучено. Ход кривой плавления принципиально не отличается от плавления белков. Как и белок, ДНК является неоднородной молекулой. Ее составляют два сорта звеньев. Пары А-Т и G-C отличаются силой связи. Первую пару легче разорвать, чем вторую. Поэтому фрагмент ДНК, которая содержит больше G-C пар, плавится при более высокой температуре. Это означает, что ширина перехода должна зависить от гетерогенности ДНК и первыми будут плавиться участки, обогащенные парами А-Т. Поэтому у природной ДНК полуширина перехода достаточно большая.

Первые эксперименты на смесях достаточно длинных природных ДНК позволили вывести простой эмпирический закон: средняя температура перехода спираль-клубок оказывается линейной функцией общего содержания G-C пар и находится между температурами разворачивания «чистых» А-U и G-C спиралей, как это показано на рисунке 16.3.

Рис. 16.3. Зависимость избыточной теплоемкости растворов ДНК от ионной силы. Концентрация NaCl изменялась от 32 до 200 мМ. Средняя величина ΔC_P составила 64.6 ±21.4 кал·град^-1·моль^-1 (Chalikian et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, pp. 7853–7858, 1999, Biochemistry)

Влияние ионной силы

Температура плавления спиральных полинуклеотидов, как естественных, так и модельных зависит от ионной силы. Это отчетливо видно из рисунка 16.4, где показана зависимость кривых плавления двойной спирали ДНК (poly AT) от ионной силы в интервале от 32 до 200 мМ NaCl. В первом приближении можно считать, что величина T_пл увеличивается пропорционально логарифму активности моновалентного иона в растворе, если концентрация соли не очень велика, и эта зависимость объясняется тем что положительные ионы экранируют отрицательные заряды фосфатного остова. Коэффициент пропорциональности зависит от размера противоиона и дистанций между заряженными фосфатными группами. Для большинства природных ДНК, имеющих конформацию В-формы, в растворах NaCl этот коэффициент пропорциональности равен около 20 К. Поскольку речь идет о чисто электростатических взаимодействиях стабилизирующий эффект ионной силы носит, в основном, энтропийный характер.

Рис. 16.4. Схематическое представление плавления молекулы ДНК. Молекула, состоящая только из А·Т пар плавится при 70°С, тогда как молекула ДНК, состоящая только из G·C пар плавится при температуре свыше 100°. В первом приближении температура плавления конкретной молекулы ДНК может быть рассчитана из ее состава. В более точных формулах учитываются стэкинг-взаимодействия между основаниями.

Ω-ДНК

Двойная спираль ДНК и ее развернутая форма в виде гауссова клубка являются каноническими структурами, которые хорошо изучены. К ним мы еще мы не раз будем возвращаться в последующих лекциях. Однако в природе, кроме этих канонических форм ДНК (А, B, Z), присутствуют «неправильные» формы ДНК. ДНК постоянно подвергается воздействию различных агентов физической и химической природы, нарушающих ее структуру и химический состав. В одной из таких форм плавное течение двойной спирали нарушается тем, что небольшая часть нуклеотидов выпячивается из нее, образуя петли, с триплетными повторами. Такие повторы потенциально опасны для жизни клетки, поскольку процессы репликации и репарации настроены природой на двойную спираль ДНК без выступов. Однако в клетке постоянно работают репарационные механизмы, исправляя такие повторы.

Недавно в лаборатории американского ученого К. Бреслауеры был создан конструкт, получивший название Ω-ДНК (рис. 16. 5).

Рис.16.5. Конструкт, имеющий форму греческой буквы омега, Ω. В петле основания отмеченные значком Х могут заменяться на триплет CAG

Этот конструкт был назван так, поскольку на плоскости он имеет форму греческой большой буквы омега, Ω. В этом конструкте последовательности двух нуклеотидов – одна длиной 42 основания, а другая 22 основания – были подобраны так, чтобы образовать двойную спираль с петлеобразным выступом на цепи из 42 оснований. Выступ содержит три триплета последовательности CAG. Выбор такой Ω-ДНК продиктован простыми обстоятельствами: конструкт идеален для исследования энергетики повреждений при влиянии замен в олигонуклеотидах.

Прямые калориметрические исследования, такого конструкта позволили впервые зафиксировать существование энергетически дискретного набора микросостояний в метастабильных структурах. На рисунке 16.6 а дано схематическое представление различных ДНК конформаций и переходов между ними, а на рисунке 16.6 б приведены кривые зависимости избыточной теплоемкости от температуры двух комплементарных цепей Ω-ДНК в соотношении 1:1, каждая из которых содержит по два триплетных выступа. Пунктирные вертикальные линии на рисунке отделяют одно энергетическое состояние от другого.

а) б)

Рис. 16.6. Промежуточные состояния в ДНК. а) Схематическое представление различных ДНК конформаций и переходов между ними. б) Кривые зависимости избыточной теплоемкости от температуры двух комплементарных цепей Ω-ДНК в соотношении 1:1, каждая из которых содержит два триплетных выступа. Кривые измерены с помощью микрокалориметра NanoDSCII. Объем ячейки 0.3 мл. Концентрация ДНК 50 мкM при расчете на одну цепь