22 Лекция 13. Ч2. Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия Термодинамика структурных превращений в нуклеиновых кислотах, липидах и сахарах
Аналитические подходы в дифференциальной сканирующей калориметрии, описанные для белков в предыдущих лекциях, полностью применимы к другим макромолекулам, например, таким как нуклеиновые кислоты, а также к их комплексам с лигандами. Однако есть одно важное отличие. Поскольку нуклеиновые кислоты имеют только четыре типа мономерных звеньев (исключение составляют только молекулы тРНК), спектр основных взаимодействий значительно уже, чем для белков.
Как показали исследования, большинство взаимодействий в высокомолекулярных нуклеиновых кислотах реализуется почти в такой же форме в относительно небольших фрагментах нуклеиновых кислот. Несмотря на то, что в природе ДНК чаще всего имеет двухцепоченую организацию, а большинство природных молекул РНК являются одноцепочечными, с помощью синтетических полимеров можно получить весь спектр конформаций от однонитевого клубка до тройных или даже четверных спиральных комплексов в той или иной степени моделирующих различные уровни самоорганизации ДНК и РНК. Поэтому, исследуя такие фрагменты, можно прийти к достаточно общим выводам о свойствах длинных нуклеиновых кислот, тогда как короткие пептиды не могут служить адекватной моделью для белков. Впрочем, данное замечание относится и к многим другим физическим методам.
Синтетические гомо- и гетеронуклеотиды
Обычно синтетические гомополимеры типа (U)n, (С)n или (А)n находятся в растворе в виде одиночных цепочек, которые при стандартных условиях имеют частично упорядоченные структуры, образующиеся за счет стэкинг-взаимодействия. Эти стэкинг-взаимодействия являются энтальпийно выгодными и вносят один из основных вкладов в термодинамику образования вторичной и третичной структуры природных ДНК и РНК. В частности, благодаря стэкинг-взаимодействиям устойчиво упорядоченными оказываются несколько остатков в антикодоновой петле тРНК. Однако, эти взаимодействия в рамках одной цепочки не приводят к образованию достаточно длинных кооперативных элементов вторичной структуры и поэтому последняя разрушается под действием тепла в очень широком температурном диапазоне, превышающем 100oС. Это же обстоятельство приводит к тому, что пространственная организация таких полимеров имеет форму клубка с достаточно большой персистентной длиной, связанной как с наличием стэкинг-взаимодействий, так и с ограничением свободы вращения в фосфодиэфирном остове.
Большинство опубликованных термодинамических данных относится к (A)n и (C)n полимерам, поскольку они имеют сравнительно стабильную ближнюю упорядоченность. Они не образуют двойных спиралей или более сложных структур в водных растворах при нейтральных рН, в то время как при закислении раствора до рН5 (А)n и (С)n способны образовывать стабильные двойные спирали со специфическими свойствами. Полиуридиловая кислота, которая неупорядочена при обычных условиях (и по этой причине в течение многих лет служила модельной мРНК в бесклеточном белковом синтезе), образует спирали только при высоких ионных силах или в присутствии специальных агентов, однако и эти спирали очень не стабильны. С другой стороны, polyG и polyU даже при умеренной ионной силе образуют разнообразные надмолекулярные структуры, которые в случае polyG очень стабильны. Следует отметить одно важное различие между двойными спиралями РНК (А-форма) и ДНК (В-форма). При одних и тех же условиях и одинаковых составах полимеров А-форма оказывается несколько более стабильной к тепловому воздействию, чем В-форма. В данном случае не количество внутримолекулярных водородных связей, а другие структурные факторы приводят к наблюдаемому эффекту.
Как
синтетические гомополинуклеотиды, так
и цепи с чередующимися основаниями
(например, (AU)n),
при определенных условиях могут
образовывать различные спиральные
комплексы. В зависимости от концентрации
цепей, ионной силы и температуры в смеси
гомополимеров polyA
и polyU могут
образовываться два типа комплексов. В
эквимолярной смеси двух полимеров при
всех значениях ионной силы и комнатной
температуре образуется стабильный
двуспиральный комплекс (A)n∙(U)n.
Если ионная сила сравнительно низка
(<0,1 M NaCl),
то эта двойная спираль при повышении
температуры распадается на свободные
цепи (A)n
и (U)n.
При более высокой ионной силе (>0.1 M
NaCl) сначала
происходит превращение двойной спирали
в тройную, а затем, при
дальнейшем повышении температуры,
тройной комплекс распадается на одиночные
нити (рис.16.1 б). При этом у polyA
имеется остаточная
структура, которая выплавляется
постепенно, что необходимо учитывать
при обработке калориметрических данных.
После введения коррекции на тепло
разрушения остаточной структуры у polyA
тепловой эффект разворачивания,
, двойной спирали (A)n∙(U)n
при 330 К оказывается равным 38,5 кДж на
моль пары оснований. При этом теплота
образования тройной спирали по абсолютной
величине несколько ниже (порядка -33
Кдж/моль пар или -52 Кдж/моль триплетов
при 330 К), что и приводит к появлению двух
пиков на правой термограмме, приведенной
на рисунке 16.1. При этом первый пик
соответствует сумме теплот двух
процессов.
Рис. 16.1. Зависимости парциальной теплоемкости эквимолярной смеси (A)n и (U)n в буфере с рН=7,0 и разными значениями ионной силы: 0,05 М для левого графика и 0,5 М для правого.
В целом из исследования модельных соединений была получена очень важная информация о двух аспектах проблемы стабильности структуры нуклеиновых кислот. Во-первых, с некоторой достоверностью удалось определить вклады индивидуальных пар и других комбинаций оснований в стабильность вторичной структуры ДНК и РНК, а также, что особенно важно, третичной структуры последних. Кроме того, были найдены вклады элементарных взаимодействий, приводящих к структуризации нуклеиновых кислот, таких как электростатические взаимодействия, водородные связи, стэкинг-взаимодействия, и взаимодействия с растворителем.