Влияние растворителя на кривые плавления белков
Растворитель играет важную роль в стабилизации конформационных (нативное и развернутое) состояний белка, а также в определении природы перехода между ними.
Стабилизация структуры путем связывания с низкомолекулярными лигандами
Лизоцим лошади состоит из двух доменов, которые разворачиваются квази-независимо и дают два пика на кривой плавления. Стабильность одного из доменов изменяется благодаря связыванию с ионами кальция, поэтому положение соответствующего пика (первого), его высота и ширина зависят от концентрации кальция в растворителе (рис. 15.9).
Рис. 15.9. Кривые плавления лизоцима лошади при pH 4.5 в присутствии различных концентраций кальция (CaCl2): кривая 1) 0.00 мМ, 2) 0.10 мМ, 3) 0.75 мМ, 4) 1.50 мМ. Пунктирная линия – функция теплоемкости от температуры, рассчитанная для несвернутого пептида, а линия пунктир-точка – для нативного состояния, полученная линейной экстраполяцией с использованием величины наклона, характерного для нативных глобулярных белков
Влияние pH
Температура разворачивания белка барназы (Tпл) возрастает от 20°C при pH 1.8 до 55°C при pH 5.5 (рис. 15.10).
Рис. 15.10. Кривые плавления барназы в растворах с различными pH, величины которых указаны над каждой кривой. Пунктирная линия и линия пунктир-точка показывают парциальные молярные теплоемкости нативного и развернутого белков. Вставка: сплошная линия показывает зависимость теплоемкости от температуры для необратимо денатурированного белка, полученная с помощью нагрева до 100oC; пунктирная линия – теплоемкость развернутого белка, рассчитанная суммированием теплоемкостей отдельных аминокислотных остатков
Приведенные кривые свидетельствует о том, что денатурация происходит как переход типа "все или ничего". Это означает, что при таком переходе только начальное (нативное) и конечное (денатурированное) состояние наблюдаются в заметных количествах, а "полуденатурированных" молекул практически нет, хотя, конечно, они могут быть в небольшом количестве. Иначе говоря, переход "все-или-ничего" является микроскопическим аналогом фазового перехода первого рода в макроскопических системах (например, плавления кристалла). Однако в отличие от истинного фазового перехода S-образность кривой ("все-или-ничего") означает не нулевую, а конечную ширину перехода. Повышенная теплоемкость белка в денатурированном состоянии является следствием возрастания поверхности контакта его гидрофобных боковых групп с водой при (частичном или полном) разворачивании белка.
Вспомним, что знание функции <ΔCP(T)> обеспечивает нам полную характеристику термодинамики перехода. Однако чистое нативное и развернутое состояния обычно реализуются в узких температурных диапазонах, поэтому температурные зависимости Cp,нат и Cp,разв можно оценить только экстраполяцией или с помощью модельных расчетов. Протоны также являются лигандами и они сильно влияют на стабильность белка (Tпл), если в последнем есть группы с аномальным значением pK. Вариации pH, сдвигая пик теплопоглощения, позволяют получить семейство кривых, как это показано на рисунке 15.10, и таким образом определить температурные зависимости термодинамических параметров перехода.