Влияние мутаций в белках на кривые плавления
Замена одного или двух аминокислотных остатков в белке, может приводить к значительным различиям в экспериментальных кривых плавления (рис. 15.7).
Рис. 15.7. Кривые плавления лизоцима фага T4. Сплошной линией обозначены данные, полученные при pH 2.8, 3.0, 3.5, 3.7. Кружками показаны данные для мутанта белка S44A при pH 4.0
Несмотря на то, что хочется приписать энтальпийный или энтропийный вклад подобных мутаций изменению белковой стабильности, однако делать это нужно с большой осторожностью, поскольку изменение стабильности может с таким же успехом быть результатом изменения кооперативности процесса разворачивания. Такое изменение стабильности может указывать на то, что замена одного аминокислотного остатка на другой существенно влияет на междоменные взаимодействия внутри молекулы белка. Так, замена серина на аланин в молекуле лизоцима T4 не только дестабилизирует белок (он разворачивается при более низкой температуре, чем белок дикого типа), но и увеличивает полуширину перехода, тем самым, указывая на снижение кооперативности процесса (рис. 15.7).
Сложные мультидоменные белки
Кривую зависимости теплоемкости от температуры для белков со сложной структурой можно разделить на составляющие кривые, которые соответствуют переходам между различными состояниями. Такое разделение делается без всяких априорных предположений, используя специальные компьютерные алгоритмы. Надежность данного анализа (некоторые авторы называют его «деконволюцией», но это не деконволюция в строгом смысле слова, а аппроксимация) зависит от точности определения экспериментальной кривой плавления. В идеале, каждый компонент кривой соответствует переходу между двумя состояниями со своими термодинамическими параметрами. Компоненты кривой плавления могут быть соотнесены со структурными единицами при обработке модельной информации о белке или с помощью исследования его фрагментов. Информацию о структурной связи между фрагментами можно получить из данных по зависимости энтальпии от температуры отдельных компонентов кривой при изменении условий, например pH. Этот метод с успехом применялся для мультидоменных белков, белок-белковых комплексов и комплексов между белками и нуклеиновыми кислотами, а также для фибриллярных белковых структур, таких как мышечные белки и коллагены. Калориметрический анализ процесса плавления миозина в качестве примера показан на рисунке 15.8.
Рис. 15.8. Калориметрический анализ миозина
Верхняя панель: схематический вид молекулы миозина. Заштрихованные места подвержены полному протеолизу (расщеплению). ЛММ и ТММ (легкий и тяжелый меромиозин) являются основными фрагментами после обработки трипсином или пепсином. Фрагмент ЛММ далее расщепляется другой протеазой (папаином), как это показано на рисунке. Здесь же можно наблюдать фрагменты дальнейшего расщепления ЛММ с помощью трипсина. Пронумерованные фигурные скобки обозначают обнаруженные с помощью калориметрического анализа кооперативные блоки, которые показаны на нижней панели.
Нижняя панель: кривые плавления фрагментов миозина в 25 мM калий фосфатном буфере, pH 6.5 и 0.5 M KCl: а) фрагмент ЛММ после трипсинового расщепления; б) фрагмент ЛММ после пепсинового расщепления; в) фрагмент ЛФ-3; г) не фрагментрированная молекула миозина. Пики переходов между двумя состояниями пронумерованы согласно возрастанию стабильности блоков и приписаны различным элементам структуры, как показано на верхней панели
Как видно из этого рисунка, сложность кривой плавления возрастает с увеличением длины фрагмента от ЛФ-3 до ЛММ. Все кривые могут быть разложены на сумму пиков, каждый из которых описывается переходом между двумя состояниями. Затем каждому пику приписывается отдельная кооперативная единица в структуре путем приблизительной оценки размера кооперативного блока из энтальпии перехода, принимая значение удельной энтальпии плавления постоянной по всей длине молекулы. Наименее стабильный кооперативный блок (фрагмент 1) лежит близко к середине молекулы. Примечательно, что блок, соответствующий фрагменту 4, отделен от других блоков областями, легко расщепляемыми протеазами и заштрихованными на рис. 15.8, которые не принимают участие в процессе плавления. Для более точной структурной интерпретации результатов аппроксимации весьма желательно использовать дополнительные, например, оптические данные.