Кооперативность плавления при денатурации
Денатурировать белок можно разными способами: добавлением в раствор денатурирующих агентов типа гуанидингидрохлорида или мочевины, нарушающих водородные связи в белке, или додецилсульфата натрия, гидрофобные хвосты которого проникают в молекулу белка и разрушают его ядро, а также сверхвысоким давлением. Кроме того, сильное изменение pH также может вызывать кислую или щелочную денатурацию белка. При этом молекулы белков принимают специфические конформации.
Начнем с денатурации теплом небольших, однодоменных белков. Денатурация холодом будет обсуждена позже в этой же Лекции. Денатурация однодоменных белков является кооперативным переходом с одновременным достаточно резким (S-образным) изменением практически всех характеристик молекулы (смотри рис. 15.1). S-образность экспериментальных кривых доказывает, что соответствующие характеристики молекулы меняются от тех, которые характерны для нативного белка, до тех, которые свойственны денатурированному, а узость кривых свидетельствует о том, что этот процесс охватывает сразу много аминокислотных остатков в белке. Однако в отличие от истинного фазового перехода, наблюдаемого, например, при плавлении кристаллов, S-образность перехода имеет не нулевую, a конечную ширину. Последнее означает, что этот переход охватывает не всю макроскопическую систему, а только её часть. Главный вопрос, который здесь возникает, прост: «Какую часть молекулы затрагивает такой переход, и можно ли получить ответ на него из данных сканирующей микрокалориметрии?»
Конформационные переходы
Калориметрическая энтальпия и энтальпия Вант-Гоффа равны между собой
Первые исследования небольших однодоменных белков с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии установили, что разворачивание их структуры под воздействием температуры можно вполне удовлетворительно описать в рамках модели кооперативного перехода между двумя состояниями.
Моделирование процесса перехода основано на сравнении калориметрической энтальпии перехода, полученной интегрированием кривой плавления, с величиной, вычисленной согласно уравнению Вант-Гоффа. Если оба значения совпадают, то считается, что переход происходит только между двумя состояниями, а вклад интермедиатов пренебрежительно мал.
Экспериментальная калориметрическая энтальпия перехода дается выражением:
(15.4)
где ΔCP,пер,изб(T) – величина пика перехода над экспериментальной базовой линией ΔCP,баз.линия,изб(T). Уравнение Вант-Гоффа соотносит энтальпию и константу равновесия между двумя состояниями:
(15.5)
Из уравнения 15.5 видно, что энтальпия перехода равна наклону кривой зависимости ln K от обратной температуры 1/RT. Заметим, что в середине перехода К = 1.
Для одностадийного перехода
константа равновесия при температуре
T выражается как:
(15.6)
где [B(T)] и [A(T)] – равновесные концентрации состояний. Таким образом, константу равновесия K(T) можно измерить в любом эксперименте, который дает отношение [B(T)] / [A(T)] как функцию температуры. Например, K(T) можно рассчитать из спектров кругового дихроизма, если состояния A и B значительно различаются, как это имеет место в случае с разворачиванием белков.
Предполагая существование только двух состояний, можно получить отношение значений их заселенностей непосредственно из формы кривой плавления.
а) б)
Рис. 15.3. Нахождение энтальпии Вант-Гоффа из формы кривой плавления: а) температурная зависимость теплоемкости барназы при рН=4,5; б) интеграл функции <ΔCp>=Cp(T) – Cp,n(T). Tпл (середина перехода) соответствует условию ΔG(Tпл) = 0
На рисунке 15.3. а показана избыточная кривая теплоемкости белка барназы, a на рисунке 15.3. б ее интеграл <ΔH(T)>. Как видно из правого рисунка калориметрическое значение теплового эффекта находится из амплитуды функции <ΔH(T)>. С другой стороны значение Вант-Гоффовой энтальпии определяется из производной в точке Тm по формуле:
(15.7)
где <ΔCp(Tпл)> – значение теплоемкости при температуре перехода Tпл, а <ΔH(Tпл)> – полное тепло, поглощенное в этой точке.
Следует отметить, что Вант-Гоффова энтальпия может быть определена из производной температурной зависимости любой функции состояния (например, вязкости или оптической плотности) в предположении об одностадийности перехода. Однако только калориметрия позволяет одновременно определить оба значения энтальпии и, в случае их равенства, сделать заключение о справедливости модели двух состояний.
После появления компьютерых алгоритмов, более современный подход заключается в подгонке экспериментальной кривой теплоемкости по формулам, записанным для модели двух состояний с помощью минимизационных алгоритмов.
Калориметрическая энтальпия и энтальпия Вант Гоффа не равны между собой
Для мономолекулярной одностадийной реакции кривая плавления, определяемая с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии, отражает действительное изменение тепла, связанное с конформационным переходом при денатурации одного моля макромолекулы, а расчетная энтальпия Вант-Гоффа соответствует количеству тепла, связанному с плавлением одного моля кооперативной единицы в макромолекуле. Поэтому, когда кооперативный домен меньше молекулы, как в случае с мультидоменными белками, то энтальпия Вант-Гоффа меньше калориметрической. Если же энтальпия Вант-Гоффа больше калориметрической, то это указывает на то, что в случае обратимости кооперативный домен больше молекулы, т.е. является доказательством присутствия межмолекулярных взаимодействий, таких как олигомеризация (рис. 15.4). Во всех случаях, когда эти энтальпии не равны, переход идет через промежуточное (ые) состояния.
Рис. 15.4. Калориметрическая энтальпия и энтальпия Вант-Гоффа для однодоменных, двухдоменных макромолекул и их димеров