Применения измерений анизотропии в биохимии

Измерение анизотропии флуоресценции широко используется в биохими­ческих исследованиях. Это происходит потому, что любые факторы, которые влияют на размер, форму и сегментальную гибкость макромолекулы, будут влиять на наблюдаемую анизотропию. Вышеперечисленные свойства макромолекул могут изменяться под воздействием рН, температуры, вязкости, денатурирующих агентов и из-за реакций ассоциации. В следующих разделах будет приведен ряд результатов, которые иллюстрируют использование и ин­терпретацию измерений анизотропии.

РИС. 5.10. Схема отбора плоскостных и внеплоскостных вращений путем выбора r₀ или длины волны возбуждения на примере перилена.

Оценка микровязкости клеточных мембран

В предыдущем разделе указывалось, что анизотропия флуоресценции сильно зависит от вязкости раствора, в котором растворен флуорофор. Именно эта зависимость привела к использованию измерения анизотропии для оценки микровязкости в области ацильных боковых цепей клеточных мембран. Выбирают флуорофор, который распределяется в такое неполярное окружение. Как правило, для этой цели служат перилен, 9-винилантрацен, 2-метилантрацен [ 4, 12] и дифенилгексатриен [ 13]. Последнее из указанных веществ наиболее широко используется в настоящее время по соображениям, которые будут обсуждены ниже. Первоначально выбирают подходящий растворитель сравнения и строят градуировочную кривую — зависимость измеренных значений анизотропии флуоресценции от известной вязкости растворителя сравнения. Типичная градуировочная кривая приведена на рис. 5.11.

РИС. 5.11. Градуировочная кривая для оценки микровязкости мембран [12].

Приведены данные по анизотропии перилена (1), 2-метилантрацена (2) и 9-винилантрацена (3) в минеральном масле.

Затем измеряют анизотропию флуоресценции для того же флуорофора, распределенного в области ацильных боковых цепей липидного бислоя. Внутренняя вязкость бислоя оценивается при сравнении с градуировочной кривой. Для малых ароматических молекул, по-видимому, наиболее вероятно то, что их эффективный молекулярный объем V будет один и тот же в растворителе и в липидном бислое. В результате градуировочная кривая зависимости r от η в растворителе известной вязкости позволяет связать анизотропию мембранно-связанного флуорофора с микровязкостью мембраны.

Типичные результаты по микровязкости, полученные при использовании перилена, показаны на рис. 5.12. Яичный фосфатидилхолин представляет собой смесь ненасыщенных фосфолипидов, которые не претерпевают фазовых переходов в изученном температурном диапазоне. Кажущаяся микровязкость низка (кривая 2) и монотонно возрастает с изменением К^-1, Дипальмитоилфосфатидилхолин – насыщенный фосфолипид, фазовый переход которого отражается в резком уменьшении микровязкости, наблюдаемом вблизи 37 °С (кривая 1).

РИС. 5.12. Результаты определения микровязкости диспергированных фосфолипидных мембран по измерению анизотропии перилена [12].

Приведены кажущиеся микровязкости для дипальмитоилфосфатидилхопина (1), яичного фосфатидилхолина (2) и смесей DPPC + холестерин (3, 4), для которых указаны молярные соотношения.

Ниже температуры перехода липидные бислои, состоящие из насыщенных липидов, должны быть довольно вязкими. На рис. 5.12 также показана кажущаяся микровязкость смесей DPPC + холестерин (кривые 3, 4). Холестерин обычно увеличивает кажущуюся микровязкость мембран. Для определения микровязкостей, приведенных на рис. 5.11 для всех трех флуорофоров, в качестве растворителя сравнения было применено минеральное масло. Эквивалентные микровязкости были получены для каждой из этих систем, что увеличивает достоверность полученных значений. Однако было бы более желательно использовать три разных растворителя сравнения, чем изучать три разные системы, так как в этом случае эксперименты выявили бы связь между скоростью вращения флуорофоров и макроскопической вязкостью растворителей [14].

После этих начальных наблюдений измерения анизотропии флуоресценции стали широко использоваться для исследования динамики мембран. Некоторые благоприятные характеристики метода, а именно относительно простая теоретическая основа, несложное и сравнительно недорогое оборудование и высокая чувствительность измерений, способствовали его широкому распространению. Благодаря высокой чувствительности появилась возможность проведения экспериментов в разбавленных суспензиях мембран, содержащих только следовые количества зондов. Типичное молярное соотношение липид/зонд находится в диапазоне 200 : 1 — 2000 : 1, а типич­ная концентрация липидов составляет 0,1 - 10 мг/мл.

На протяжении последнего десятилетия наиболее широкоиспользуемым зондом для оценки вязкости мембран был DPH. Это, по-видимому, вызвано несколькими причинами. У DPH высокий коэффициент экстинкции (~80000 М^-1 . см^-1), что позволяет исследовать разбавленные растворы, а предельная анизотропия постоянна в диапазоне 320 — 380 нм, что определяет выбор длины волны возбуждения. Деполяризационные вращения DPH, по-видимому, изотропны. Вращение вокруг длинной оси молекулы может быть быстрым, но оно не смещает момента перехода, и, следовательно, такое вращение неактивно в деполяризации. (Искривления, заметные на рис. 5.11 для других зондов, происходят частично из-за анизотропных вращений несимметричных молекул.) И наконец, отчетливо проявляются фазовые переходы мембран. Этот факт иллюстрирует рис. 5.13, на котором приведены микровязкости, определенные с помощью DPH, для фосфолипидных везикул различного химического состава [15]. Из полученных данных видно, что кажущаяся микровязкость бислоев сильно зависит от их фазового состояния. Интересно отметить, что с другими флуорофорами, такими, как 12-антроилоксистеарат, 1-анилино-8-нафталинсульфонат, N-фенил-1-нафтил-амин, перилен и 9-винилантрацен, наблюдаются менее резкие изменения.

РИС. 5.13. Значения кажущейся микровязкости, полученные из измерений анизотропии DPH [15].

Приведены значения натурального логарифма кажущейся микровязкости от обратной температуры для малых однослойных везикул, приготовленных из DOPC (1), DMPC (2), DPPC (3), DSPC (4).

Очевидно, что измерения анизотропии флуоресценции могут значи­тельно расширить возможности изучения физико-химических свойств липидных бислоев. Однако важно понять и запомнить допущения, которые были сделаны при оценке микровязкости. Главное из них состоит в том, что градуировочная кривая, построенная при использовании изотропного растворителя сравнения, пригодна для флуорофоров, распределенных в анизотропное окружение липидных бислоев. Приходится принимать, что деполяризационные движения флуорофора идентичны в таком разном окружении. Это предположение было проверено несколькими другими методами (разд. 6.2.1), и в настоящее время известно, что оно некорректно: в липидных бислоях диффузионные движения флуорофоров обычно затруднены, т.е. флуорофоры не могут вращаться больше чем на определенный угол. В изотропном растворителе сравнения подобных угловых ограничений нет. Это не умаляет пользы измерений анизотропии для изучения клеточных мембран, но показывает, что нужно быть осторожным в интерпретации получаемых значений микровязкости.