Измерение электрического двойного лучепреломления

Измерение двойного лучепреломления макромолекул в растворе требует достаточно изощренных оптических схем. Напомним еще раз основы возникновения DR в кристаллах. В оптически анизотропных кристаллах (a их в природе большинство) наблюдается явление двойного лучепреломления, которое состоит в том, что луч света, падающий на поверхность кристалла, раздваивается в нем на два преломленных луча. В одноосном кристалле один из лучей, образующихся при двойном лучепреломлении, подчиняется обычным законам преломления света и поэтому его называют обыкновенным лучом и обозначают буквой о. Второй луч обозначают буквой е, так как он не лежит в плоскости падения. Если параллельный пучок света, прошедшего через поляризатор, падает нормально на поверхность плоскопараллельной пластинки, вырезанной из одноосного кристалла параллельно его оптической оси MN, то на входе в кристаллическую пластинку электрические векторы о и е волн колеблются в одной фазе. В пластинке о и е волны распространяются с разными скоростями, поэтому на выходе из пластинки толщиной d волны будут колебаться со сдвигом по фазе. В зависимости от толщины пластинки возможно несколько частных случаев. Один из них соответствует сдвигу фаз π/2. Такая пластинка называется пластинкой в четверть длины волны. Угол преломления r_e зависит от того, как ориентирована поверхность пластинки по отношению к оптической оси кристалла.

Основная схема эксперимента по DR приведена на рисунке 28.7. Свет из лазерного источника, распространяющийся вдоль z-оси, проходит последовательно поляризатор, ячейку Керра и анализатор. Луч поляризуется поляризатором, который располагается под углом 45^o по отношению к электрическому полю, и затем попадает на ячейку. Когда раствор после приложения импульса становится двулучепреломляющим, свет, выходящий из раствора, оказывается эллиптически поляризованным. Затем свет проходит через анализатор, который расположен под углом 90^o по отношению к поляризатору, и после этого попадает на детектор. В эксперименте могут использоваться две оптические схемы: без пластинки и с пластинкой в четверть длины волны.

Рис. 28.7. Схема эксперимента по электрическому DR. При воздействии электрического поля молекулы в ячейке частично ориентируются и раствор проявляет двойное лучепреломление. При использовании стандартной оптической схемы электрическое поле направлено вдоль x-оси, которая находится под углом 45^o по отношению к поляризатору и анализатору. Последние расположены под углом 90^o относительно друг друга

В простейшем оптическом приборе без пластинки в четверть длины волны изменения интенсивности света, под действием электрического поля , регистрируемые детектором сигналы можно выразить уравнением , где δ – оптическое замедление, обусловленное электрическим полем, и I₀ – интенсивность света, который попадает на детектор, если поляризатор и анализатор параллельны, а δ равняется нулю. Для δ <<1 мы получаем приближенную формулу . Эта схема обладает тем недостатком, что её чувствительность мала при небольших значениях δ и знак δ остается неизвестным.

В другом варианте оптическое устройство включает пластинку в четверть длины волны, которая расположена между кюветой Керра и анализатором. Анализатор может вращаться на угол α от крестообразного положения.

Эллиптически поляризованный свет, исходящий из двулучепреломляющего раствора, превращается в линейно поляризованный свет, после прохождения через пластинку в четверть длины волны, угол поляризации которой зависит от величины оптического замедления δ, обусловленного электрическим полем. В этой оптической схеме зависимость между и для δ <<1 описывается уравнением:

(28.19)

Следовательно, пропорциональна δ, а не δ². В этом случае чувствительность выше, чем без использования пластинки в четверть длины волны. Более того, световой сигнал усиливается, при положительном значении δ и уменьшается при его отрицательном значении. Это позволяет определить знак двойного лучепреломления.

Кривая спада двойного лучепреломления обычно представляется в полулогарифмической шкале, как показано на рисунке 28.9.

Рис. 28.9. Кривая спада двойного лучепреломления для фрагмента ДНК размером 98 пар оснований в полулогарифмическом масштабе аппроксимируется одной экспонентой в области свыше двух порядков спада интенсивности сигнала. Условия проведения эксперимента: 2.0 мM Tрис-HCl -буфер, pH 8.0, 4^◦С; длительность импульса 2 мкс, амплитуда импульса 5 кВ·cек^-1. Вставка: та же кривая, построенная в линейной шкале по оси ординат (Hagerman, 1985)

Если исследуемые молекулы являются жесткими и имеют одинаковые размеры (монодисперсный раствор), то зависимость как функция времени, является прямой линией с положительным наклоном, равным 1/τ.

Что касается белков, то если они аппроксимируются сферой радиуса R₀, все τ_k времена релаксации (включая τ _нач и τ _ср) сводятся к одному значению, τ_0, которое равно:

(28.24)