Седиментация в градиенте плотности
Метод седиментации в градиенте плотности в исследовании нуклеиновых кислот и белков имеет длительную историю и сегодня находит широкое применение в различных областях – от определения состава генома до характеристики взаимодействий белок-детергент, комплексов белков с нуклеиновыми кислотами и липидами. Ниже мы опишем классический подход, базирующийся на аналитическом скоростном зональном центрифугировании, равновесной седиментации в градиенте плотности, а также изопикническом центрифугировании.
Метод скоростного зонального центрифугирования
Образец раствора, содержащий смесь частиц, наслаивается на поверхность вещества, создающего градиент повышающейся плотности (рис. 25.5 a).
Рис. 25.5. Скоростное зональное разделение смеси частиц в градиенте плотности. a) Образец содержит смесь частиц различного размера, формы и плотности, который наслаивается на поверхность вещества, создающего градиент. Плотность увеличивается по направлению к дну пробирки. б) В результате частицы разделяются в зависимости от их размера, формы и плавучей плотности. Поделенные на фракции молекулы отбираются из различных зон градиента
При центрифугировании частицы проходят через градиент, образуя зоны в соответствии с их скоростью седиментации. Центрифугирование прекращается, прежде чем частицы, разделенные на зоны, осядут на дно ячейки (рис. 25.5 б). Максимальная плотность градиента выбирается так, чтобы она не превышала ту плотность, при которой частица находит свою зону. Плотность и вязкость градиента среды, а также скорость центрифугирования влияют на разделение. Растворы сахарозы и глицерина наиболее часто используются для создания градиента при скоростном зональном центрифугировании. Линейный градиент 5-20% сахарозы традиционно используется для разделения белков и нуклеопротеидов. Методом скоростного зонального центрифугирования можно разделить смесь молекул по их коэффициентам седиментации, которые определятся их размером, формой и плавучей плотностью, а также определить относительную молекулярную массу. Правда следует заметить, что коэффициенты седиментации, получаемые методом зонального центрифугирования в градиенте сахарозы, могут быть ошибочными для белков с обратимой самоассоциацией или взаимодействующих с другими макромолекулами. Источником ошибки является молекулярный эффект уплотнения, обусловленный высокой концентрацией сахарозы, из-за чего сдвигается равновесие в пользу ассоциированных макромолекул. В этом случае рекомендуется использовать классический метод AUC для точного определения коэффициентов седиментации. Глобулярные белки с большей молекулярной массой и большей плотностью осаждаются ближе к дну пробирки, а таковые с меньшими размерами и плотностью остаются ближе к поверхности пробирки. Для иллюстрации метода, на рисунке 25.6 показано разделение 22S рибонуклеопротеидных частиц методом центрифугирования в градиенте сахарозы. Пик I соответствует 22S рибонуклеопротеидным частицам.
Рис. 25.6. Выделение 22S рибонуклеопротеидных частиц методом центрифугирования в градиенте сахарозы 5-20%, при 50 000 об·мин-1 в течение 3 часов при температуре 20оC в роторе SW 55