Биологическая химия. Берёзов Т.Т. / Биологическая химия. Т.Т. Берёзов

сродство к гликопротеину CD4 Т-лимфоцита. В этом взаимодействии, узнавании, являющемся высокоспецифичным, гликозилированные фрагменты, вероятнее всего, играют важную патогенетическую роль. Известно также, что при ревматоидных артритах часто синтезируются аномальные антитела (аномальные иммуноглобулины–все гликопротеины) с необычайно короткими сахарными цепями, что вызывает стимуляцию иммунной системы против самого организма. Из этих примеров видно, что, помимо гликобиологии, наступило время признания и таких наук, как гликопа- т о л о г и я и г л и к о т е р а п и я .

Помимо гликопротеинов, различают также протеогликаны, состоящие из белка и г л и к о з а м и н о г л и к а н о в (прежнее название мукополисахариды); последние состоят из цепей сложных углеводов: аминосахаров, уроновых кислот, серной кислоты и отдельных моносахаридов. Типичными гликозаминогликанами являются гиалуроновая кислота, хондроитинсерная кислота и гепарин, химический состав, структура и функция которых подробно рассматриваются в главе 21.

К типичным гликопротеинам относят большинство белковых гормонов, секретируемые в жидкие среды организма вещества, мембранные сложные белки, все антитела (иммуноглобулины), белки плазмы крови, молока, овальбумин, интерфероны, факторы комплемента, группы крови, рецепторные белки и др. Из этого далеко не полного перечня гликопротеинов видно, что все они выполняют специфические функции: обеспечивают клеточную адгезию, молекулярное и клеточное узнавание, антигенную активность опухолевых клеток, оказывают защитное и гормональное, а также антивирусное действие.

Химический состав гликопротеинов более или менее установлен, структура определена только у ряда из них. К полипептиду присоединяются гетероолигосахаридные цепи, содержащие от 2 до 10, реже 15 мономерных остатков гексоз (галактоза и манноза, реже глюкоза), пентоз (ксилоза, арабиноза) и конечный углевод, чаще всего представленный N-ацетилга- лактозамином, L-фукозой или сиаловой кислотой; в отличие от протеогликанов гликопротеины не содержат уроновых кислот и серной кислоты.

N-ацетилгалактозамин L-фукоза Сиаловая кислота (6-дезоксигалактоза) (N-ацетилнейраминовая

кислота)

Типы связей между углеводными компонентами и белками определены только у ряда гликопротеинов, аминокислотный состав и структура которых известны (иммуноглобулины, гормоны); они включают О-гликозидные

91

связи (с ОН-группами серина, треонина и оксилизина), N-гликозидные связи (с амидными группами аспарагина, реже глутамина или ω-NH2-группами лизина и аргинина) и эфирные гликозидные связи со свободными СООН-группами глутаминовой и аспарагиновой кислот.

Синтез гликопротеинов осуществляется в рибосомах эндоплазматического ретикулума (в цистронах), затем присоединяются сахарные цепи (постсинтетическое гликозилирование), и далее белок транспортируется до биомембран клетки и включается в состав мембранных белков или секретируется.

Углеводные компоненты соединены ковалентно с азотом аспарагина молекулы белка. Однако предварительно олигосахаридная часть соединяется с липидным переносчиком–долихолфосфатом (липид, содержащий от 15 до 20 изопреновых остатков) и переносится на полипептидную цепь в эндоплазматическом ретикулуме, при этом транспортер освобождается:

Долихолфосфат (n = 15–30)

Синтезированные гликопротеины далее переносятся в аппарат Гольджи, где осуществляются окончательное гликозилирование и сортировка по назначению.

Структура одного из нескольких гетероолигосахаридных остатков в молекуле гликопротеинов, в частности иммуноглобулинов, может быть представлена в виде следующей схемы (использованы сокращения: Глю – глюкоза, NАцГлюА – N-ацетилглюкозамин; Гал–галактоза; Ман–манно- за; NАцНейр – N-ацетилнейраминовая кислота):

Рассмотрим известные к настоящему времени данные о синтезе, строении (структуре) и свойствах ряда гликопротеинов.

Интерфероны. Интерфероны–это ингибиторы размножения многих типов вирусов. Открыто несколько типов интерферонов (α, β и γ), некоторые из них получены методами генетической инженерии. Это сравнительно небольшие сложные белки с мол. массой у разных видов животных и человека от 25000 до 38000–40000). Они образуются в клетке в ответ на внедрение вирусной нуклеиновой кислоты, ограничивая вирусную агрессию (инфекцию). Известно также, что группа видоспецифических α-интерфе- ронов синтезируется макрофагами, в то время как γ-интерферон продуцируется Т-клетками и стимулируется интерлейкином-2 (см. «Лимфокины»). Показано также, что γ-интерферон в свою очередь повышает цитотоксическую активность макрофагов, Т-клеток и естественных кле- ток-киллеров. Интерфероны наделены антипролиферативной активностью и считаются основными защитными белками не только против вирусной инфекции, но и при опухолевых поражениях.

92

Следует отметить, однако, что до сих пор не раскрыты молекулярные механизмы, при помощи которых интерфероны тормозят размножение вирусов. Известно только, что интерфероны ингибируют биосинтез всех белков (и хозяйских, и вирусных), вероятнее всего, на уровне процесса трансляции. Возможно, что интерферон индуцирует синтез особого бел- ка-ингибитора, который затем связывается с рибосомами и блокирует трансляцию, или интерферон переводит один из активных эукариотических белковых факторов инициации в неактивный фактор путем фосфорилирования.

Иммуноглобулины. Иммуноглобулины, или антитела, также относятся к классу гликопротеинов, выполняют защитную функцию, обезвреживая поступающие в организм чужеродные вещества–антигены любой химической природы. Синтезируются иммуноглобулины плазматическими клетками, образовавшимися из лимфоцитов. Учение об иммунитете оформилось в самостоятельную науку–иммунологию, изучающую структуру

ифункции антител вообще и иммуноглобулинов в частности. Мы представим современные сведения о некоторых физико-химических свойствах

иструктуре иммуноглобулинов человека (табл. 2.4). Различают 5 классов иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Детально изучены структура

ифункция IgG.

Таблица 2.4. Свойства иммуноглобулинов человека

Разные классы иммуноглобулинов сильно различаются не только по молекулярной массе, но и по концентрации в крови; имеются данные, что различаются они и по биологическим свойствам.

Подробно изучена структура IgG. Он имеет Y-образную форму и тетрамерное строение; состоит из двух идентичных легких L-цепей (от англ. light) и двух идентичных тяжелых Н-цепей (от англ. heavy) с мол. массой 23000–24000 и 50000–70000 соответственно. Известно также, что каждая из этих цепей имеет 2 типа доменов–вариабельные (V) участки, состоящие из 108 аминокислотных остатков, и константные (С) участки, состоящие из 110 и 350 аминокислотных остатков соответственно в L- и Н-цепях (рис. 2.5).

Из других гликопротеинов, выполняющих ряд важнейших биологических функций, следует отметить все белки плазмы крови (за исключением альбуминов), трансферрин, церулоплазмин, гонадотропный и фолликулостимулирующие гормоны, некоторые ферменты, а также гликопротеины в составе слюны (муцин), хрящевой и костной тканей и яичного белка (овомукоид). Углеводные компоненты, помимо информативной функции,

93

Рис. 2.5. Структура IgG человека. Показаны легкие (L) и тяжелые (Н) цепи, дисульфидные связи и вариабельные V (красные) и константные С (светлые) участки.

значительно повышают стабильность молекул, в состав которых они входят, к различного рода химическим, физическим воздействиям и предохраняют их от действия протеиназ, определяя тем самым биологическую роль гликопротеинов. Являясь составной частью клеточной мембраны, гликопротеины участвуют, кроме того, в иммунологических реакциях, ионном обмене, процессах межклеточной адгезии и т.д.

МЕТАЛЛОПРОТЕИНЫ

Кметаллопротеинам относятся биополимеры, содержащие, помимо белка, ионы какого-либо одного металла или нескольких металлов (табл. 2.5).

Ктаким белкам принадлежат, например, белки, содержащие негемовое

железо, а также белки, координационно связанные с атомами металлов в составе сложных белков-ферментов.

Типичными представителями первых являются железосодержащие белки ферритин, трансферрин и гемосидерин. Ферритин – высокомолекулярный водорастворимый белок с мол. массой 400000, в котором содержание железа составляет от 17 до 23% (в среднем 20%). Он сосредоточен главным образом в селезенке, печени, костном мозге, выполняя роль депо железа в организме. Железо в ферритине находится в окисленной форме, в составе неорганического железосодержащего соединения (FeO•OH)8•(FeO•O•PO3H2), причем цепи неорганического полимера O=Fe—OH...O=Fe—ОН..., иногда содержащие фосфаты, находятся между пептидными цепями белковой части (называемая апоферритином), а атомы железа координационно связываются с атомами азота пептидных

94

Глава 3

ХИМИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

В наше время трудно назвать область естествознания, которую не интересовала бы проблема структуры и функций нуклеиновых кислот. Несмотря на огромный прогресс, достигнутый в последние десятилетия при изучении химического состава и строения нуклеиновых кислот, много проблем предстоит еще решить для выяснения зависимости между структурой и биологической ролью нуклеиновых кислот. Нет сомнения, что именно на этом пути научного поиска исследования нуклеиновых кислот будут сделаны открытия, имеющие огромное значение для биологии, медицины и всей науки о живом. Эпохальное открытие принципа комплементарности нуклеиновых кислот позволило проникнуть в тайны не только тонкой структуры этих биополимеров, но и механизмов синтеза и воспроизведения биологических макромолекул. Нуклеиновые кислоты выполняют ряд важных биологических функций, не свойственных другим полимерным веществам. В частности, они обеспечивают хранение и передачу наследственной информации и принимают непосредственное участие в механизмах реализации этой информации путем программирования синтеза всех клеточных белков. Структурные компоненты нуклеиновых кислот выполняют, кроме того, функции кофакторов (коэнзим А, уридиндифосфатглюкоза и др.), аллостерических эффекторов, входят в состав коферментов (никотинамидадениндинуклеотид, флавинадениндинуклеотид и др.), принимая тем самым непосредственное участие в обмене веществ, а также в аккумулировании (накоплении), переносе и трасформации энергии. Они являются предшественниками вторичных посредников (мессенд- жеров)–циклических мононуклеотидов (цАМФ и цГМФ), выполняющих важную функцию в передаче внутриклеточных сигналов. Подробно основные функции нуклеиновых кислот рассмотрены в главе 14.

Методы выделения нуклеиновых кислот. При изучении химического состава и строения нуклеиновых кислот перед исследователем всегда стоит задача выделения их из биологических объектов. В главе 2 было указано, что нуклеиновые кислоты являются составной частью сложных белков – нуклеопротеинов, содержащихся во всех клетках животных, бактерий, вирусов, растений. Нуклеиновые кислоты обладают сильно выраженными кислыми свойствами (обусловлены остатками ортофосфорной кислоты в их составе) и при физиологических значениях рН несут отрицательный заряд. Этим объясняется одно из важных свойств нуклеиновых кислот–способ- ность к взаимодействию по типу ионной связи с основными белками (гистонами), ионами металлов (преимущественно с Mg2+), а также с полиаминами (спермин, спермидин) и путресцином. Поэтому для выделения нуклеиновых кислот из комплексов с белками необходимо прежде всего разрушить эти сильные и многочисленные электростатические связи между положительно заряженными молекулами белков и отрицательно заряженными молекулами нуклеиновых кислот. Для этого измельченный путем

96

гомогенизации биоматериал обрабатывают крепкими солевыми растворами (10% раствор хлорида натрия) с последующим осаждением нуклеиновых кислот этанолом. В настоящее время для выделения нуклеиновых кислот в нативном состоянии пользуются более «мягким» фенольным методом, основанным на обработке нейтрального забуференного раствора нуклеопротеинов фенолом. Обычно эту процедуру проводят в присутствии веществ, вызывающих денатурацию белкового компонента, например додецилсульфата (ДСН) или салицилата натрия, затем смесь подвергают центрифугированию. При этом денатурированный белок попадает в фенольную фазу, а нуклеиновые кислоты остаются в водной среде, из которой их осаждают на холоде добавлением 2–3 объемов этанола. Этим методом удается получить достаточно очищенные препараты нуклеиновых кислот.

В настоящее время применяют ряд усовершенствованных методов разделения нуклеиновых кислот на фракции из суммарного препарата, полученного описанным методом. Это прежде всего хроматография на геле фосфата кальция, ионообменная хроматография (в качестве адсорбентов используют ДЭАЭ-целлюлозу, ДЭАЭ-сефадекс и др.), ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы, хроматография по сродству на белковых носителях, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, гельэлектрофорез и др.

После получения нуклеиновых кислот в чистом виде их подвергают гидролизу для изучения химического состава. Для этих целей используют ферментативные методы (экзо- и эндонуклеазы), а также чисто химические методы гидролиза, в частности нагревание нуклеиновых кислот с хлорной кислотой.

ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) относятся к сложным высокомолекулярным соединениям, состоят из небольшого числа индивидуальных химических компонентов более простого строения. Так, при полном гидролизе нуклеиновых кислот (нагревание в присутствии хлорной кислоты) в гидролизате обнаруживают пуриновые и пиримидиновые основания, углеводы (рибоза и дезоксирибоза) и фосфорную кислоту *:

В молекуле ДНК углевод представлен дезоксирибозой, а в молекуле РНК–рибозой, отсюда их названия: дезоксирибонуклеиновая (ДНК) и рибонуклеиновая (РНК) кислоты. Кроме того, они содержат фосфорную кислоту, по два пуриновых и по два пиримидиновых основания; различия только в пиримидиновых основаниях: в ДНК содержится тимин, а в РНК – урацил. В составе ДНК и РНК открыты так называемые минорные

* В составе ДНК открыт также кремний в количестве 0,26–0,31%, поэтому предполагают, что он в нуклеиновых кислотах изоформен фосфору и способен включаться в полинуклсотидную последовательность.

97

(экзотические) азотистые основания (строение некоторых из них приводится далее).

Углеводы (рибоза и дезоксирибоза) в молекулах ДНК и РНК находятся в β-D-рибофуранозной форме:

В составе некоторых фаговых ДНК обнаружена молекула глюкозы, которая соединяется гликозидной связью с 5-оксиметилцитозином.

Основу структуры пуриновых и пиримидиновых оснований составляют два ароматических гетероциклических соединения–пиримидин и пурин *:

Молекула пурина состоит из двух конденсированных колец: пиримидина

иимидазола.

Всоставе нуклеиновых кислот встречаются три главных пиримидиновых

основания: цитозин, урацил и тимин.

Помимо главных пиримидиновых оснований, в составе нуклеиновых кислот открыты минорные пиримидиновые основания, 5-метил- и 5-окси- метилцитозин, дигидроурацил, псевдоурацил, 1-метилурацил, оротовая кислота, 5-карбоксиурацил, 4-тиоурацил и др. Забегая несколько вперед, укажем, что только для тРНК список минорных оснований приближается к 50. На долю минорных оснований приходится до 10% всех нуклеотидов тРНК, что имеет, очевидно, важный физиологический смысл (защита

*Для удобства представления структурных формул азотистых оснований и углеводов

вдальнейшем в структуре колец опущены атомы С и Н.

98

молекулы РНК от действия гидролитических ферментов). Структурные формулы ряда минорных пиримидиновых оснований представлены в форме нуклеозидов–соединений с углеводным компонентом:

Два пуриновых основания, постоянно встречающихся в гидролизатах нуклеиновых кислот, имеют следующее строение:

К минорным нуклеозидам пуринового ряда, обнаруживаемым в составе ДНК и РНК, относятся инозин, N6-метиладенозин, N2-метилгуанозин, ксантин, гипоксантин, 7-метилгуанозин и др.

Одним из важных свойств свободных азотистых оснований (содержащих оксигруппы) является возможность их существования в двух таутомерных формах, в частности лактим- и лактамной формах, в зависимости от значения рН среды: при рН 7,0 они представлены в лактамной форме, при снижении величины рН–в лактимной форме. Таутомерные превращения можно представить на примере урацила.

99

Оказалось, что в составе природных нуклеиновых кислот все оксипроизводные пуринов и пиримидинов находятся в лактамной форме.

О локализации и количественном содержании нуклеиновых кислот

вклетках получены определенные данные. Доказано, что количественное содержание ДНК в клетках одного и того же организма отличается удивительным постоянством и исчисляется несколькими пикограммами, однако в клетках разных видов живых организмов имеются существенные количественные различия в содержании ДНК. Хорошо известно также, что ДНК преимущественно сосредоточена в ядре, а в митохондриях и хлоропластах содержится только небольшой процент клеточной ДНК. О количестве РНК нет точных данных, поскольку содержание ее в разных клетках

взначительной степени определяется интенсивностью синтеза белка. На

долю РНК приходится около 5–10% от общей массы клетки. Современная классификация различных типов клеточной РНК основывается на данных топографии, функции и молекулярной массы. Выделяют три главных вида РНК: матричную (информационную)–мРНК, которая составляет 2–3% от всей клеточной РНК; рибосомную–рРНК, составляющую 80–85% и транс- портную–тРНК, которой около 16%. Эти 3 вида различаются нуклеотидным составом и функциями (табл. 3.1).

Таблица3.1. Свойства РНК у Е.coli (по А. Ленинджеру)

Матричная РНК (мРНК) синтезируется в ядре на матрице ДНК, затем поступает в рибосому, выполняя матричную функцию при синтезе белка (см. главу 14). По предположению акад. А.С. Спирина, часто мРНК при поступлении из ядра в цитоплазму образует со специфическими РНК-свя- зывающими белками комплексы–так называемые информосомы, способные к обратимой диссоциации. Информосомы рассматриваются как транспортная форма мРНК, способствующая образованию полирибосом в цитоплазме. Транспортные РНК (тРНК) имеют небольшую молекулярную массу и содержатся в растворимой фракции цитоплазмы, выполняя функцию переноса аминокислот к месту белкового синтеза–рибосоме. Рибосомные РНК (рРНК), как видно из данных табл. 3.1, имеют разную и значительно большую молекулярную массу. Они локализуются в двух субчастицах рибосом 50S и 30S у Е.coli и 60S и 40S в клетках животных (табл. 3.2).

Субчастица 60S содержит три разных рРНК (5S, 5,8S и 28S рРНК), в то время как субчастица 40S – одну молекулу 18S рPHK. Детально роль рРНК в белковом синтезе пока не выяснена (см. главы 13, 14).

100