3.3. Приготування живильних середовищ

Виробничу культуру одержують вирощуванням мікроорганізмів на поверхні твердого або рідкого ЖС і в об’ємі рідкого ЖС.

На ріст мікроорганізмів і біосинтез ними ферментів впливає ряд чинників:

• склад ЖС, умови його приготування і стерилізації;

• умови аерування вирощуваної культури мікроорганізму;

• умови процесу одержання виробничої культури.

Хімічний склад живильних середовищ.

Для кожного продуцента склад ЖС підбирають індивідуально. Найважливіша вимога до складу ЖС – його повноцінність. Воно повинно містити компоненти, які забезпечують нормальний ріст мікроорганізмів і біосинтез ними ферментів.

Живильні речовини витрачаються мікроорганізмами на побудову нових клітин тазабезпечення енергією основних життєвих процесів.

Мікроорганізми дуже чутливі до складу ЖС, на якому їх вирощують, окремі речовини вони інтенсивно споживають, а інші залишаються майже невикористаними, хоча їх присутність необхідна.

До складу ЖС у визначених кількостях повинні входити, насамперед, речовини, що містятьвуглець, азот, водень і кисень, мінеральні елементи (кальцій, магній, фосфор, сірка, залізо, калій), вітаміни, стимулятори росту. Середовище повинне мати певне значення рН, тому слід передбачити, щоб у процесі культивування не відбувалися небажані зміни рН.

Мікроорганізми засвоюють вуглець переважно з органічних сполук, кисень – з оснóвного складу середовища і з повітря, водень – з води і органічних сполук.

Вуглець визначає основні метаболічні шляхи життєдіяльності мікроорганізму. Основним джерелом вуглецю є вуглеводи; після їх витрати засвоюються проміжні продукти перетворень цукрів. Позитивний вплив на ріст клітин мікроорганізмів і біосинтез ферментів має введення в середовище жирів, які також виконують функції піногасника.

Джерелом азоту є органічні речовини і неорганічні солі. Значну кількість азотовмісних органічних речовин містять кукурудзяний екстракт, соєве і пшеничне борошно, гідролізат казеїну, екстракт міцелію мікроскопічних грибів тощо. Мінеральний азот у складі середовищ представлений амонійними солями та нітратами.

Найшвидше засвоюється азот у відновленій формі, тому швидкість споживання мікроорганізмами органічних речовин і амонійних солей значно вища, ніж нітратів. Споживання мікроорганізмами різних джерел азоту веде до значної зміни реакції середовища. Споживання амонійних солей внаслідок засвоєння катіону веде до підкислення середовища, а споживання продуцентами нітрат-іонів зумовлює його лужну реакцію. Сумісне використання мінеральних та органічних джерел азоту в живильному середовищі характеризується синергічною дією на процес культивування.

Велике значення для синтезу біомаси мікроорганізмів і нагромадження ферментів має співвідношення між вуглецем і азотом в живильному середовищі. Нестача одного з них не компенсується надлишком іншого. При культивуванні окремих продуцентів лише зміною цього співвідношення можна одержувати у культуральній рідині різні ферменти.

Оптимальне співвідношення С/N складає: для протеїназ – (18-34)/1, для амілаз – (10-40)/1, для пектиназ – (3-5)/1. Відхилення від оптимального співвідношення різко гальмує біосинтез ферментів.

Важливу роль у процесах обмін речовин відіграють вітаміни, стимулятори росту,мікроелементи. Залежно від того, чи потребують мікроорганізми введення у живильне середовище вітамінів, вони поділяються на:

• ауксоавтотрофи – синтезують їх самостійно;

• ауксогетеротрофи – потребують обов’язкового введення вітамінів до складу середовища.

Якщо продуцентом є ауксоавтотрофний мікроорганізм, введення до складу середовища стимуляторів росту і вітамінів не впливає на його ріст і розвиток. Якщо ж продуцент – ауксогетеротроф, то введення навіть невеликих кількостей цих речовин помітно прискорює його ріст і розвиток.

Джерелом вітамінів і стимуляторів росту в живильному середовищі є автолізати мікробних мас, різноманітні рослинні відходи (кукурудзяний екстракт, спиртова барда, відвари борошна, вичавки плодів і овочів). Оскільки ці компоненти середовища є одночасно джерелом вуглецю, азоту, фосфору, які визначають їх витрату, то кількість вітамінів і стимуляторів росту у середовищах є достатньою і не вимагає їх додаткового введення.

Для життєдіяльності мікроорганізмів і синтезу ферментів необхідна присутність у ЖС ряду мікро- та макроелементів, які складають основу мінерального живлення.

Дуже важливим елементом живильного середовища є фосфор. Фосфор стимулює біосинтез протеаз, амілаз, пектолітичних ферментів. Потребу культури у фосфорі можна приблизно визначити шляхом аналізу золи мікробної маси продуцента.

Фосфор вноситься в середовище з солями фосфорної кислоти, інколи з органічними сполуками, наприклад фітином, або з різними природними субстратами: рослинними відварами, борошном, кукурудзяним екстрактом тощо. Найкращі результати досягаються, якщо фосфор додатково вноситься з солями фосфорної кислоти.

Токсичні речовини. Відомо, що ріст і розвиток мікроорганізмів пов’язані зі здійсненням численних ферментативних реакцій, які відбуваються за законами конкурентного і неконкурентного інгібування. Токсичний вплив на життєдіяльність мікроорганізмів вже при вмісті в природному живильному середовищі в мільйонних частках виявляють галогени, формальдегід, фенол, толуол, бензол, ртуть, кадмій, діоксид сірки і ряд інших речовин.

Види і основні компоненти живильних середовищ

Мета приготування живильних середовищ полягає у створенні з окремих компонентів певної регламентованої суміші з необхідними параметрами (вологістю, pH тощо). Способи приготування живильних середовищ різні і залежать від складу його компонентів.

Залежно від складу, ЖС поділяються на синтетичні та комплексні.

До синтетичних належать середовища, що складаються з індивідуальних речовин та мають визначений кількісний склад. Джерелом вуглецю в таких середовищах є вуглеводи, спирти, органічні кислоти; джерелом азоту – азотовмісні солі, амінокислоти, сечовина тощо.

Комплексні середовища містять багаті органічними сполуками природні продукти і відходи ряду виробництв. Комплексні середовища значно дешевші і доступніші, тому їх використовують частіше. Компонентами комплексних середовищ можуть бути висівки і борошно зернових культур, меляса, гідрол, кукурудзяний екстракт, замочні води, барда спиртових заводів, відходи каропляно- і кукурудзяно-крохмального виробництв тощо.

Як основний компонент для приготування ЖС при поверхневому способі культивування використовують пшеничні висівки та біошрот.

Як додатковий компонент, який відіграє роль розрихлювача середовища та збагачує його поживними речовинами і стимуляторами росту мікроорганізмів, використовують солодові паростки, лузгу круп’яних культур, буряковий жом, дерев’яну тирсу, вичавки плодів, овочів, ягід.

Основним недоліком вищеперелічених компонентів ЖС є нестабільність їх складу, тому кожна нова партія сировини повинна перевірятися у лабораторних умовах шляхом дослідного культивування продуцента.

Як регулятор кислотності до складу середовищ вводять крейду.

Як піногасники використовують жири і олії, які одночасно є джерелом вуглецевого живлення для мікроорганізмів. До них належать: кашалотовий жир, олеїнова кислота, соєва, соняшникова, бавовняна, кукурудзяна олія. Найширше застосування знаходять кашалотовий жир і олеїнова кислота, оскільки олії мають харчову цінність.

Середовище готують у стерилізаторі або в апараті з перемішуючим пристроєм, куди дозують окремі компоненти, зволожують їх водою, стерилізують живильне середовище та охолоджують.

При глибинному культивуванні нерозчинні та малорозчинні компоненти використовують лише при періодичному культивуванні. Для безперервного процесу важлива відсутність твердих частинок, які погіршують реологічні властивості середовища і ускладнюють подальшу переробку готової культуральної рідини. Тому, при приготуванні живильних середовищ з природної сировини використовують відвари рослинної сировини, а також грубі фільтрати клейстеризованого борошна, спиртової барди, гідролізати або плазмолізати мікробної маси, добавки солей, рідше окремі компоненти.

Живильне середовище готують з вмістом сухих речовин від 2,5 до 20% на водопровідній воді. Живильне середовище контролюють за значенням pH під час гомогенізації та після стерилізації.

Обов’язково дотримуються певної послідовності змішування компонентів.

При безперервному способі стерилізації ЖС компоненти вуглецевої природи готують окремо від компонентів середовища, що містить азотисті речовини. При періодичному способі, якщо середовище стерилізують у ферментаторі, всі його компоненти розчиняють у воді і змішують в одній ємності.

Для приготування ЖС використовують ємності циліндричної форми з плоским або сферичним днищем, з барботерами для подачі повітря та пари і мішалками. Апарати виготовляють з нержавіючої сталі або зі сталі з антикорозійним покриттям.

Готові напівпродукти перекачують або подають самопливом у ферментатор по трубопроводах, на яких встановлено спеціальні захисні сітки – вловлювачі для крупних частинок.

При невеликих потужностях виробництва живильне середовище готують в одному апараті.

Кожна партія сировини вимагає чіткого мікробіологічного та біохімічного контролю.