Приготовление реактивов:

Приготовление 1%-ного раствора яичного белка. Белок куриного яйца фильтруют через марлю и затем разводят дистиллированной водой 1:10

Приготовление реактива Миллона: 40 г ртути растворяют в 57 мл концентрированной азотной кислоты (ρ = 1,4 г/мл) сначала при комнатной температуре, а затем в водяной бане. Раствор разводят 2 объемами воды с небольшим количеством 1%-ного раствора нитрита калия и нитрита натрия. Через некоторое время жидкость сливают с отстоявшегося остатка. При длительном хранении реактив окисляется.

α-Нафтол, 0,1% спиртовой раствор: 0,1 г α-нафтола растворяют в 100 мл 70%-ного спирта.

Гипобромит натрия, 2%-ный раствор: 2 г брома (0,65 мл, относительная плотность 3,12 г/мл) растворяют в 100 мл 5%-ного раствора гидроокиси натрия при охлаждении (лед). Приготовление реактива ведут под тягой.

Опыт 1 Биуретовая реакция

(на обнаружение пептидных связей в белках)

В щелочной среде в присутствии солей меди белки дают фиолетовое окрашивание. Окраску дает комплексное соединение меди с пептидными группами: -СО-NH-. Биуретовая реакция получается также с продуктами неполного гидролиза белка – пептонами и полипептидами.

Эта реакция является универсальной для всех белков, так как она открывает наличие не менее двух пептидных связей (первичную структуру белка).

В основе биуретовой реакции лежит способность пептидных связей (-СО–NН -) в щелочной среде образовывать с сульфатом меди окрашенные комплексные соединения, цвет которых зависит от длины полипептидной цепи.

Раствор нативного белка дает сине-фиолетовое окрашивание, а продукты его гидролиза (пептиды) – красно-фиолетовый цвет.

Свое название биуретовая реакция получила от производного мочевины - биурета, который дает эту реакцию. Биурет образуется при нагревании мочевины с отщеплением от нее аммиака.

NH₂ NH₂

\ -NH₃ \

2 C = О → C = О

∕ ∕

NH₂ NH

_{мочевина} \

C = О

∕

NH_{2 биурет}

Биуретовая реакция получается также е некоторыми немногочисленными соединениями, не содержащими пептидных групп (например, при наличии в молекуле групп –CS – NH- или =СН– NH-).

Биуретовую реакцию дают: аминокислоты гистидин и амид аспарагиновой кислоты - аспарагин.

Ход работы: 1. Помещают в сухую пробирку несколько кристалликов мочевины и нагревают на слабом огне. Мочевина сначала плавится. Когда сплавленная масса начнет твердеть, нагревание прекращают и дают пробирке остыть. В результате нагревания из мочевины образуется биурет, а аммиак улетучивается (об этом узнают по запаху).

2. К полученному в пробирке биурету прибавляют около 1 мл 20% раствора сернокислой меди. При встряхивании получается характерное розовато-фиолетовое окрашивание. Необходимо избегать прибавления избытка раствора сернокислой меди, так как голубая окраска получающегося гидрата окиси меди может маскировать реакцию.

3. Проделывают биуретовую реакцию с раствором белка. В пробирку вносят 5-10 капель 1%-ного раствора яичного белка, 3-6 капель 10%-ного раствора гидроксида натрия и 1-2 капли 1%-ного раствора сульфата меди и перемешивают. Содержимое пробирки приобретает сине-фиолетовое окрашивание.

Нельзя добавлять избыток сульфата меди, так как синий осадок гидрата окиси меди маскирует характерное фиолетовое окрашивание биуретового комплекса белка.