Лабораторная работа № 6 Протеолиз

Расщепление белковых веществ катализируется протеолитическими ферментами. Протеолитические ферменты (или протеазы) в зависимости от характера их действия делятся на 2 группы: протеиназы и полипептидазы.

Протеиназы гидролизуют белки до аминокислот и пептидов, полипептидазы действуют на пептиды, расщепляя их до аминокислот.

В растениях содержатся протеолитические ферменты, называемые протеиназами типа папаина. Папаин обладает смешанными функциями протеиназы и полипептидазы, а потому расщепление белка под действием папаина идет с образованием пептидов и аминокислот.

Расщепление белка под действием протеолитических ферментов, называется протеолизом.

Степень протеолиза определяется либо путем химического анализа по накоплению водорастворимого азота, аминного азота или свободных аминокислот, либо физическими методами: по скорости разжижения желатина, по изменению консистенции клейковины и другими путями.

Опыт 1 Определение активности протеиназ

(по учету водорастворимого азота, после 1-2-х или 3-х часов протеолиза)

Ход работы. 5 г испытуемого материала и 30 мл воды, нагретой до 40⁰С, переносят в колбу, смешивают и ставят в термостат на 1-2 часа или 3 часа для протеолиза.

По истечении указанного времени добавляют смесь Барштейна (10 мл 6% раствора сернокислой меди и 10 мл 1,25% раствора едкого натрия) для прекращения ферментативного процесса и осаждения белков, тщательно перемешивают и ставят на 30 мин, в водяную баню при 45-50⁰С. После этого охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через складчатый фильтр. Первые партии мутного раствора (фильтрата) сливают обратно на фильтр. Для определения растворимых форм азота, не осаждаемых смесью Барштейиа, берут 10 мл прозрачного фильтрата в колбу Къельдаля и определяют азот по методу Кьельдаля. Активность протеиназ выражают в мг небелкового азота на 10 г испытуемого материала.

Одновременно проводят контрольное определение водорастворимого азота - поступают также как при определении активности протеиназ, но без настаивания, т.е. сразу испытуемый материал смешивают с водой и реактивом Берштейна, чтобы предупредить действие ферментов.

Амилолитические ферменты

В растениях запасной углевод - крахмал под действием ферментов амилаз может превращаться в декстрины и дисахарид мальтозу.

Амилазы (иначе называются диастазы) широко распространены в природе, они встречаются во всех растительных и животных организмах.

Амилазы встречаются в виде 2-х ферментов: осахаривающего и декстрирующего. Осахаривающий фермент был назван сахарогенамилазой или (β-амилазой).

β-амилаза содержится в растениях (в клубнях картофеля, в покоящихся семенах хлебных злаков, в семенах сои). При действии на крахмал β-амилазы образуется около 54% мальтозы и декстрины.

Декстрирующий фермент α-амилаза находится во всех животных организмах, особенно в больших количествах образуется в поджелудочной железе и в слюнных железах, α-амилаза содержится также в низших растениях (плесневые трибы), в семенах сорго и в проросших семенах (солоде) ржи, пшеницы, проса и ячменя. Б солоде содержится как α-, так и β-амилаза.

Образующиеся под действием амилазы продукты расщепления крахмала с йодом быстро теряют синюю окраску. Вначале они дают с йодом фиолетовую окраску, затем она переходит вследствие образования промежуточных продуктов расщепления крахмала амилазой - декстринов меньшего молекулярного веса, по-разному окрашивающихся от йода. В зависимости от окраски с йодом различают

следующие промежуточные продукты расщепления крахмала: Амилодекстрины - (средний молекулярный вес около 10.000), окрашиваются йодом в сине-фиолетовый цвет, осаждаются спиртом, вращают плоскость поляризации,

[а]²⁰д =+196°, восстанавливают реактив Фелинга на 1% по отношению к мальтозе. По своему строению они близки к крахмалу.

Эритродекстрины - (средний молекулярный вес 6.000-4.000) окрашиваются йодом в красно-бурый цвет, осаждаются спиртом, вращают плоскость поляризации.

[а]²⁰д =+194°, восстанавливают раствор Фелинга на 2-3%.

Ахроодекстрины - (средний молекулярный вес 3700). Почти не окрашиваются йодом, растворяются в 70% спирте, вращают плоскость поляризации.

[а]²⁰д = +192°, обладают 10% восстанавливающей способностью по отношению к мальтозе.

Мальтодекстрины - (средний молекулярный вес около 1000). Не окрашиваются йодом, не осаждаются спиртом, вращают плоскость поляризации на [а]²⁰д = +183°, обладают восстанавливающей способностью на 30-40% по отношению к мальтозе.

Ферменты α- и β-амилазы проявляют свою активность в несколько разных условий температуры и реакции среды. На этом основано разделение ферментов и определение их активности. β-амилаза разрушается при нагревании до 70%С, тогда как α-амилаза при этой температуре сохраняет свою активность.

Влияние активной кислотности на действие амилолитических ферментов показывает, что один из них - α-амилаза проявляет наибольшую активность в слабокислой среде, при рН 6,3-5,6.

При более кислой реакции - при 4,8-3,3 этот фермент теряет свою активность. Фермент β-амилаза в кислой среде не инактивируется. Он имеет оптимум действия при рН 4,8.

Таким образом, декстринирующие и осахаривающие ферменты действуют при разной реакции среды.

Амилолитические ферменты являются однокомпонентными ферментами. Расщепление крахмала у растений и животных может протекать также под действием фермента фосфорилазы, которая расщепляет каждую связь 1-4 в амилозе и в амилопектине; но по месту разрыва присоединяется не вода, а остаток фосфорной кислоты, причем образуется глюкозо - I-фосфат. Поэтому этот процесс называется не гидролиз, а фосфоролиз.