4. Виявлення пептидного зв'язку між амінокислотами.

У молекулах білків усі амінокислоти зв'язані пептидним зв'язком (первинна структура протеїнів). Пептидний зв'язок виявляється за допомогою біуретової реакції Піотровського по утворенню фіолетово-червоної сполуки груп (СООН) з міддю в сильно-лужному середовищі.

Об'єкт дослідження: 1. Яєчний білок, 1% - й розчин;

2. Молоко;

3. Желатин, 1 %-й розчин;

4 Глікоколь, 1 %-й розчин.

Обладнання і посуд: 1. Штатив з пробірками;

2. Піпетка на 1 мл;

3. Крапельниці.

Реактиви: 1. Гідроксид натрію, 10 % - й розчин;

2. Мідь сірчанокисла, 5 % - й розчин.

Техніка виконання роботи

В одну пробірку наливають 1 мл розчину яєчного білка, другу - стільки ж молока, у третю - желатину, у четверту - глікоколю. До кожної пробірки доливають рівний об'єм гідроксиду натрію, перемішують і додають по 1мл розчину сірчанокислої міді. Слід уникати надміру СuSO₄, синій колір якого буде маскувати фіолетово-червоне забарвлення, яке свідчить про наявність пептидних зв'язків. Визначають зміну забарвлення в кожній пробірці.

5. Кількісне визначення ά-аміногруп формольним титруванням.

Кількісне визначення α-аміногруп можливо виконати одночасно з визна-ченням карбоксильних груп титруванням, тому що кількість карбоксильних груп еквівалентна кількості пов'язаних з формальдегідом α-аміногруп.

Об'єкт дослідження: розчин будь-якої амінокислоти або гідролізат білка.

Обладнання і посуд: 1. Штатив з пробірками;

2. Піпетки на 1; 5; 10 мл;

3. Колби 100 мл.

Реактиви: 1. Гідрооксид натрію, 0,05 н розчин;

2. Фенолфталеїн, 0,1 % -й розчин у 50 % - му етанолі;

3. Формольна суміш;

4. Дистильована вода.

Техніка виконання роботи

Готують дві колби об'ємом 100 мл. До однієї вносять 40 мл розчину, який досліджується, до другої – 40 мл дистильованої води. Додають по 10 крапель розчину фенолфталеїну та розчин 0,05 н NаОН до появи ледве помітного рожевого кольору. Потім до обох колб додають по 10 мл формольної суміші та титрують з бюретки розчином гідроксида натрія до появи ледь помітного рожевого забарвлення. Колір контролю та розчину, який досліджується, повинен бути однаковим.

Масову концентрацію амінокислот (мг/мл) розраховують за формулою:

C = (A-B)fQ/V,

де А і В – об'єми розчину гідроксида натрія, що пішов на титрування проби та контролю відповідно (мл);

f – коефіцієнт поправки на титр 0,05 моль/л розчину гідроксида натрія;

Q – маса амінокислот, що еквівалентна 1 мл 0,05 моль/л розчину гідроксида натрія (0,7 мг);

V – об'єм розчину амінокислоти, що був взятий для аналізу.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 3

«Кольорові реакції на амінокислоти»

Мета заняття: вивчити кольорові реакції на амінокислоти.

План заняття

1.Виявити наявність тирозину у складі різних білків за допомогою ксантопротеїнової реакції.

2.Виявити наявність триптофану у складі білків за допомогою реакції Адамкевича.

3.Визначити наявність метіоніну у складі білків.

4.Виявити наявність гістидину за допомогою реакції Ерліха.

Присутність білка можна виявити низкою кольорових реакцій. Ці реакції зумовлені наявністю в молекулі білка тієї чи іншої амінокислоти або хімічного групування, яке вони утворюють. Тому кольорові реакції на білки використовують для доказу білкової природи речовини, вивчення амінокислотного складу різних природних білків і кількісного визначення в білках тієї чи іншої амінокислоти.

1.Виявлення тирозину у складі різних білків (ксантопротеїнова реакція).

Білки під час нагрівання з міцною азотною кислотою дають жовте забарвлення. Реакція зумовлена наявністю в білку ароматичних амінокислот, які зазнають нітрування азотною кислотою. Ці нітропохідні амінокислоти забарвлені у жовтий, а у лужному середовищі — в оранжевий колір (солі хіноїдної структури).

Об'єкт дослідження: 1. Яєчний білок;

2. Розчин желатину.

Обладнання і посуд: 1. Штатив із пробірками;

2.Піпетки;

3. Крапельниці;

4. Нагрівальний прилад.

Реактиви: 1. НNО₃ концентрована;

2. NаОН, 30 % - й розчин.

Техніка виконання роботи

В одну пробірку вносять 1 мл розчину яєчного білка, у другу – 1 мл желатину. Добавляють по 1 мл концентрованої НNОз і обережно (!) нагрівають. У разі появи жовтого забарвлення суміш охолоджують і додають розчин 30 %-й NаОН по краплинах до появи оранжевого забарвлення.

.