«Окислювально-відновлювальні ферменти (оксидоредуктази)»

Мета заняття: вивчити вплив різних факторів на активність оксидоредуктаз.

План заняття

1.Вивчити окислення формальдегіду дегідрогеназою молока.

2.Виявити вплив підвищеної температури на активність пероксидази хріну.

3.Дослідити властивості рибофлавіну утворювати зворотню окислювально-відновлювальну систему.

4.Визначити роль поліфенолоксидази овочів у зміні їх забарвлення.

Клас оксидоредуктаз включає ферменти, що беруть участь в окисленні та відновлюванні різних речовин. Окислення може здійснюватися декількома шляхами:

1 . АО + ½ О₂ АО₂ (приєднання кисню);

2 . АН₂ + В А + ВН₂ (відняття водню);

3 . А²⁺ А³⁺ + е^­0 (відняття електрона).

Ферментам цього класу належить важлива роль у диханні та бродінні. До оксидоредуктаз належать, зокрема, дегідрогенази, оксидази і пероксидази.

Дегідрогенази. Дегідрогенази каталізують окислення субстрату шляхом відняття від нього водню, тобто перенесення водню від донора (здатного до окислення субстрату) на відповідний акцептор. Акцептором може бути кисень або будь-яка речовина, що міститься у тканинах організму. У дослідах використовують штучний акцептор – метиленову синь (МС). Дегідрогеназа відбирає водень від субстрату і віддає його МС, яка відновлюється і перетворюється в безбарвну сполуку (МСН₂). Отже, обезбарвлення розчину може свідчити про дію дегідрогенази. Лейкоформа (МСН₂) легко окислюється киснем повітря, тому досліди проводять при відсутності повітря ( у пробірках Тунберга або звичайних пробірках під шаром рослинної олії).

Оксидази. Окислення різних субстратів за рахунок кисню повітря каталізують оксидази. До цієї групи ферментів належать поліфенолоксидаза і тирозиназа. Саме дією поліфенолоксидази пояснюється потемніння поверхні розрізаного яблука або картоплини. Цей фермент окислює полі- і монофеноли, дубильні речовини та інші органічні сполуки з утворенням темнозабарвлених продуктів. Тирозиназа бере участь в окисленні амінокислоти тирозину до темного пігменту меланіна («мелас» – від грецьк. чорний).

Пероксидаза. У лабораторіях широко використовують метод визначення активності пероксидази, в основу якого покладено окислення пірогалолу в присутності перекису водню до пурпурогаліну, що утворює в розчині червоно-бурий осад.

1. Окислення формальдегіду дегідрогеназою молока

У молоці містяться дегідрогенази, що потрапляють із молочної залози та з мікрофлори молока. Альдегіддегідрогеназа окислює формальдегід до мурашиної кислоти.

Об’єкт дослідження: Молоко (джерело ферменту).

Обладнання і посуд: 1. Штатив із пробірками;

2. Термостат;

3. Водяна баня на 40^оС;

4. Годинник або секундомір.

Реактиви: 1.Формальдегід, 0,4%-й розчин;

2. Метиленова синь (МС), 0,001%-й розчин;

3. Трихлороцтова кислота, 20%-й розчин.

Техніка виконання роботи

В одну пробірку вливають 5 мл кип’яченого молока, у другу – 5 мл свіжого. В обидві пробірки додають 0,5 мл розчину формальдегіду та 3 краплі розчину МС. Вміст струшують і пробірки розташовують у водяній бані (40⁰С). Фіксують час, необхідний для знебарвлення МС. Активність дегідрогенази виражають у хвилинах, необхідних для знебарвлення МС. Одержані результати записують і роблять висновок.

Одержані результати записують і пояснюють.

У всіх дослідах з дегідрогеназами використовували ТХО або високу температуру для інактивації ферменту. Ці фактори незворотне денатурують ферментний білок, тому при послідуючій інкубації в оптимальних умовах активність ферментів не виявлялася (контрольний варіант дослідів).