Глава 1. Методы изучения микроорганизмов

В среднем линейные размеры бактерий находятся в пределах 0,5 – 3 мкм, но есть среди бактерий и свои «гиганты» и «карлики». В частности, клетки нитчатой серобактерии Beggiatoa alba имеют диаметр до 500 мкм, а длина клеток спирохет может быть до 250 мкм; клетки серных бактерий рода Thiomargarita бывают размером до 0,75 мм. Самые мелкие из известных бактерий – микоплазмы, имеющие диаметр клеток 0,1–0,15 мкм. Вирус коровьей оспы достигает размеров 0,26 мкм

Размеры дрожжей, мицелиальных грибов, простейших и водорослей находятся в пределах 10–100 мкм.

1 миллиметр (мм) = 10^3 микрометров (мкм) = 10^6 нанометров (нм) = 10^7 ангстрем (Å) = 10^11 пикометров (пм).

Патогенных микроорганизмов человека насчитывается около 3 – 4 тысяч видов, из них более 100 составляют вирусы. Сейчас описано около 10 000 видов, а предполагается около 1 млн. видов.

Есть также микроорганизмы, названные условно патогенными. К методам исследования любых микроорганизмов относятся:

1. Микроскопия: световая и электронная;

2. Культуральный метод;

3. Биологический метод;

4. Молекулярно-генетический метод;

5. Серологический метод

Строение микроскопа. Любой световой микроскоп состоит из (двух) трёх частей: оптический, механической, осветительной. К оптической составляющей относятся объективы, окуляры, увеличительные и разделительные призмы.

К механической части относятся тубус, конденсор, головка микроскопа, предметный стол, тубусодержатель с внутренними механизмами регулировки. Тубус примыкает к головке микроскопа, на которой расположен револьвер со сменными объективами.

Предметный стол в современных микроскопах представляет собой сложную конструкцию. Перемещения предметного стола регулируются при помощи двух винтов: макровинта (или кремальеры) и микровинта.

Параграф 1. Микроскопические методы

Светопольная микроскопия. Это микроскопия прямого света. Преображение света в конденсоре ограничивается собиранием или рассеиванием светового пучка, который проходит через светофильтры, через объект исследования и попадает на окуляр. Наверняка хоть раз в жизни всем приходилось сталкиваться с подобной вещью.

Этот способ позволяет микроскопировать объекты величиной 0,2 – 0,3 мкм, иначе световая волна будет дифрагировать через объект. Частным случаем является ультрафиолетовая световая микроскопия (объекты до 0,1 мкм).

Темнопольная микроскопия. Есть два типа темнопольных конденсоров – кардиоид и параболоид. Их вы можете видеть на слайде. Их функция – рассеивание светового пучка таким образом, чтобы через препарат проходили только косые лучи и, преломляясь, попадали на объектив. Здесь в объектив попадают только дифрагирующие и рассеянные лучи, которые важны для процедуры отображения. Объекты выглядят светящимися на тёмном фоне. При темнопольной микроскопии достигается видимость цветных структур, превосходящая таковую у обычного микроскопа. Это позволяет различать у объекта более тонкие структуры, придаёт им контраст на тёмном фоне.

Фазово-контрастная микроскопия. ФК-метод идеален для изучения бесцветных объектов. Проходя через тела с разным коэффициентом преломления и толщиной, световая волна изменяет свою фазу. Человеческий глаз не может заметить этого фазового отличия.

Свет линейно поляризуется специальной заслонкой (поляризатором), и разделяется в призме на два потока. Эти потоки пронизывают две близкорасположенные части образца. С ними происходят различные сдвиги по фазе, преломления и проч., и в ту же секунду оба луча соединяются двойной линзой и после прохождения через анализаторный светофильтр, и вновь пропускаются через поляризатор.

Изображение может быть позитивным (тёмные объекты на светлом фоне) и негативным (наоборот), самое важное – оно получается чрезвычайно контрастным.

Регулируя этот механизм, можно по совокупности промежуточных изображений получить полное представление о внутренней структуре объекта.

Чтобы уловить разницу между отдельными оттенками используется компенсатор, который суммирует видимые и невидимые эффекты, и строит цветную картинку.

Поляризационная микроскопия. Он используется для образцов, которые способны изменять полярность световой волны. Это свойство называется двойным лучепреломлением. Примеры – кристаллы, полезные ископаемые, полимеры. Если такие структуры есть в живых тканях, они становятся отчётливо видны как светящиеся, в то время как их окружение остаётся тёмным.

Основан этот эффект на использовании двух поляризаторов, один находится над объектом, другой под ним. Они пропускают свет только с определённой полярностью. Этот свет проходит через объект, и, если там ничего нет, то при повороте поляризаторов относительно друг друга наблюдаются четыре отчётливые фазы угасания и высвечивания изображения.

Если есть вещества с двойным лучепреломлением, то их фазы угасания и высвечивания будут смещены относительно всего изображения, мы будем получать то чёрные точки на светлом фоне, то белые точки на тёмном фоне.

Люминесцентная микроскопия. Основана на явлении фотолюминесценции.

Первичная (собственная) люминесценция наблюдается без предварительного окрашивания объектов, вторичная (наведённая) возникает после окраски препарата флюоресцирующими красителями – флюорохромами. Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычными методами обладает рядом преимуществ: возможность исследования живых организмов и обнаружение их в исследуемом материале в небольших концентрациях вследствие высокой контрастности.

Также достаточно популярным способом является инициирование флюоресценции. При облучении объекта УФ-лучами некоторое время можно наблюдать эффект поглощения-испускания света. Сущность его такова: объект забирает себе часть энергии высокочастотной волны при поглощении, и излучает обратно волну с более низкими частотами колебания. УФ лучи сами по себе невидимы, но излучение отраженного света становится видимым. Для работы с УФ лучами требуется противорадиационный щиток.

Электронная микроскопия. Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности обычных микроскопов. Электронный микроскоп применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур, и других субмикроскопических объектов. Световые лучи в таких микроскопах заменяются потоком электронов, имеющих при определённых ускорениях длину волны около 0,005 мкм, что в 100 000 раз короче длины видимого света. Высокая разрешающая способность микроскопа, составляющая 0,1 – 0,2 нм, позволяет получить общее полезное увеличение в 1 000 000 раз.

Описать устройство

Наряду с приборами «просвечивающего» типа используют сканирующие электронные микроскопы, обеспечивающие рельефное изображение поверхности объекта. Разрешающая способность у этих микроскопов значительно ниже, чем у просвечивающих.