4 Сырье, используемое при производстве глутаминовой кислоты.

При промышленном культивировании в качестве источника углерода используют легкоассимилируемые углеводы (сахарозу и глюкозу), содержащиеся в свекловичной мелассе, гидроле, гидролизатах крахмала. Источником азота являются мочевина, реже хлорид и сульфат аммония, кукурузный экстракт, причем последний применяют только на стадиях получений инокулята и посевного материала, в основном по причине большого со­держания в нем биотина. Повышенное содержание биотина в мелассе также может ограничить использование ее как основного источника сырья для биосинтеза.

Все продуценты глутаминовой кислоты биотинзависимые, а некоторые из них и тиаминзависимые, однако содержание био­тина регламентировано и не должно превышать 2—5 мкг на 1 л среды. Более высокая концентрация этого витамина излишке стимулирует рост клеток продуцента, способствует повышенному образованию, алаиина, молочной, янтарной, аспарагниовой кислот, а выход глутаминовои кислоты при этом значительно сни­жается.

Ингибирующее влияние биотина удается снизить при включении в состав питательных сред различных добавок в виде не­которых спиртов, ПАВ, антибиотиков (пеннициллинов, тетрациклинов). Добавки в среду ПАВ в количестве 0,01—-0,2% или калиевой соли бензилпенициллина (4—6 тыс. ед. на I л среды) повышают биосинтетическую способность продуцента на 15 - 45% и выход глутаминовой кислоты достигает 50 г/л. Действие антибиотиков, по-видимому, связано с ингибированием синтеза липопротеинового комплекса клеточной оболочки продуцен­та, что приводит к увеличению проницаемости клеточных мем­бран для глутаминовой кислоты.

В зависимости от особенностей используемого штамма коли­чество азота в виде мочевины, включаемого в питательные среды для осуществления процесса биосинтеза, составляет 1,0 - 2,0%. Для создания оптимальных условий биосинтеза и увеличения количества производимой глутаминовой кислоты в единице объема культуральной жидкости процесс по завершению накопления основной массы клеток проводят с подпиткой раст­вором мочевины. Содержание ее в культуральной жидкости не должно превышать 0,8%, а рН раствора должно быть в пределах 6,8—7,8. Недостаток азота в среде снижает выход глутаминовой кислоты, способствуй накоплению повышенных количеств а-кетоглутаровой кислоты.

5 Технологическая схема производства глутаминовой кислоты с описанием процессов, осуществляемых на производственных стадиях.

При биосинтезе глутаминовой кислоты непосредственным ме­таболическим предшественником служит 2-кетоглутаровая кисло­та, которая образуется обычно благодаря функционированию в клетках цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) или его части. Син­тез глутаминовой кислоты происходит в результате ферментатив­ного восстановительного аминирования 2-кетоглутаровой кисло­ты за счет НАД- или НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназы:

2-Кетоглутаровая кислота способна также вступать в реак­цию переаминирования с аминокислотами, осуществляемую тран-саминазами. Коферментом в реакции переаминирования служит пиридоксаль-5-фосфат:

В ЦТК 2-кетоглутаровая кислота образуется из изолимонной кислоты под действием изоцитратдегидрогеназы. Необходимый для синтеза глутаминовой кислоты НАД(Ф)Н постоянно регене­рируется при окислении изолимонной кислоты в 2-кетоглутаровую.

Анализ ферментных систем ЦТК у продуцирующего глутаминовую кислоту штамма Mlcrococcus glutamicus (по современной классификации Corynebacterium glutarnicurn показал, что у него имеются все ферменты, кроме 2-кетоглутаратдегидрогеназы, превращающей 2-кетоглутаровую кислоту в сукцинил-КоА (рис. 2).

Рис. 2

Не менее важный фактор — слабая активность оксидазной системы, окисляющей глутаминовую кислоту, что позволяет со­хранить синтезированный продукт количественно.

Слабокислая реакция, наличие невысоких концентраций био­тина и относительно высокая концентрация аммония, а также присутствие ионов Zn²⁺ способствует превращению глутаминовой кислоты в глутамин по ходу ферментации.

В промышленности глутаминовую кислоту и на ее основе глутамат натрия получают несколькими способами: многоста­дийным химическим синтезом из акрилонитрила, микробиологи­ческим синтезом по одноступенчатой и двухступенчатой техно­логии, выделением из свекловичной мелассы или из белковых гидролизатов. Наибольшее распространение поручили способы выделения глутаминовой кислоты из свекловичной мелассы и одноступенчатого микробиологического синтеза. Последний счи­тается самым перспективным.

В промышленном биосинтезе L-глутаминовой кислоты исполь­зуются те же микроорганизмы, что и в микробиологическом про­изводстве L-лизина, т. е. Coryn. gluiamicum и Brev. ftavum.. Кроме них, промышленными продуцентами могут быть некоторые штаммы бактерии Mictococcus и Microbacterlum.

Для осуществления процесса биосинтеза глутаминовой кисло­ты с высоким выходом используют мутанты с нарушенной фер­ментативной системой превращения а-кетоглутаровой кислоты в янтарную. При этом, если культура обладает недостаточностью по биосинтезу аланиндегидрогеназм и лактатдегадрогенезы, то выход глутаминовой кислоты будет увеличиваться за счет от­сутствия расхода углеводов среды на биосинтез аланина и мо­лочной кислоты.

Одноступенчатый способ получения.

Принципиальная техно­логическая схема культивирования продуцента и биосинтеза глутаминовой кислоты практически полностью повторяет схему микробиологического производства L-лизина. Поэтому будут рас­смотрены только некоторые отличия, наблюдаемые на стадиях культивирования продуцента и проведения биосинтеза.

Посевной материал на каждой из стадии его получения (от пробирок до посевного аппарата) выращивают в строго асепти­ческих условиях по 24 ч. Состав питательных сред незначи­тельно меняется при переходе от одного штамма к другому и практически остается постоянным на каждой из промежуточных стадий получения посевного материала. Только при выращива­нии продуцента в посевном аппарате в питательную среду вно­сят до 0,1% стерильного синтетического пеногасителя.

Для промышленных штаммов Coryn. gtutamicum питательные среды при производстве посевного материала, как правило, со­держат следующие компоненты (в %):

Питательные среды на стадии биосинтеза содержат те же компоненты и в том же количестве, только вместо кукурузного экстракта и сульфата аммония присутствует до 2% мочевины, содержание мелассы увеличивают до 20%, дополнительно вводят мел до 1% и 0,1% синтетического пеногасителя.

Накопление биомассы до 6—8 г АСВ на 1 л среды производят в аэробных условиях сначала в инокуляторах объемом 2 м³, по­том в посевных аппаратах объемом 5 м³. Полученный посевной материал в количестве 5—6% (от объема среды производствен­ных аппаратов) стерильно передают в основные фермен­таторы.

Процесс биосинтеза осуществляют в строго асептических ус­ловиях в ферментаторах объемом 50 м³ с коэффициентом за­полнения аппарата 0,7 в течение 48—52 ч и интенсивной аэрации [80—85 мг О2/(л-мин)], что соответствует расходу 1 объема воздуха на I объем среды в 1 мин. Температуру культивирования на всех стадиях поддерживают постоянной на уровне 28—30°С. В конце процесса биосинтеза готовая культуральная жидкость содержит до 45 г/л глутаминовой кислоты. Выход глутаминовой кислоты по отношению к потребленным сахарам составляет 45— 50%.

Поскольку производство глутаминовой кислоты направлено на получение высокоочищенных препаратов, последующая техно­логическая схема предусматривает производство продуктов, под­готовленных непосредственно к применению в качестве пищевых добавок и в виде лекарственных форм.

Выделение глутаминовой кислоты из культуральной жидкости и последующая очистка ее в соответствии с требованиями фарма­копеи предполагает такую последовательность проведения техно­логических операций.

Предварительная обработка культуральной жидкости. Осу­ществляется в результате добавлений к ней определенного количества негашеной извести (или известкового молока) с по­следующим осаждением избытка ионов кальция фосфорной кис­лотой. Образующийся при этом осадок способствует лучшему отделению клеток продуцента и других балластных примесей.

Отделение осадка. Проводят центрифугированием или фильт­рованием под давлением.

Рис. 3: Рамный фильтр-пресс: 1 – лобовина, 2 – рама, 3 – плита, 4 – брус, 5 – подвижная лобовина, 6 – гидравлическое устройство, 7 – прилив, 8 – кран.

Осветление фильтрата. Состоит в очистке его от пигментных примесей, окрашивающих нативный раствор в темный цвет. Для этого обрабатывают фильтрат активированным углем или подвергают его ионообменной сорбции на анионите ИА-1.

Концентрирование осветленного раствора глутаминовой кис­лоты. Проводят путем его вакуум-выпаривания при температуре 40—60°С, при этом из исходного раствора глутаминовой кислоты отгоняют от 50 до 80% воды.

Рис.4 : Выпарные аппараты: а – с центральной циркуляционной трубой, б – с выносной нагревательной камерой, 1 – корпус, 2 – нагревательные трубки, 3 – циркуляционная труба, 4 – сепаратор, 5 – отбойник.

Осаждение кристаллов глутаминовой кислоты в изоэлектрической точке. Эта стадия осуществляется путем подкисления полученного на предыдущем этапе концентрата соляной кислотой до рН 3,2 (изоэлектрическая точка глутаминовой кислоты) и ох­лаждения раствора до 4—15°С. Однократное проведение опера­ции обеспечивает кристаллизацию 77% глутаминовой кислоты; при повторном ее проведении выход возрастает до 87%. Чистота получаемый кристаллов достигает 88%.

В результате последующей перекристаллизации чистоту по­лучаемых кристаллов можно увеличить до 99,6%, что удовлет­воряет требованиям фармакопеи.

Отделение кристаллов гдутаминовой кислоты от маточника. Это достигается центрифугированием с последующей декантаци­ей и возвратом маточника на стадию вакуум-выпаривания. По­лученные кристаллы промывают обессоленной водой и направ­ляют на сушку.

Сушка кристаллов глутаминовой кислоты. Проводится в ва­кууме или в токе нагретого воздуха при 60—70°С.

Получение глутмата натрия HOOCCH₂CH₂CH(NH2)COONa*Н₂О). Процесс осуществляется обработкой влажных кристал­лов перекристаллизованной глутаминовой кислоты гидроксидом натрия. Для этого влажные кристаллы растворяют в опре­деленном количестве воды и нейтрализуют 45—50%-ным раст­вором едкого натра, рН раствора доводят до 6,8 после чего его фильтруют. Осветленный раствор глутамата натрия упари­вают под вакуумом до содержанки сухих веществ около 60% и передают на кристаллизацию. Ее проводят в течение трех суток при постепенном снижении температуры. Кристаллы глутамата натрия отделяют от маточного раствора центрифу­гированием и сушат в токе горячего воздуха,

В соответствии с требованиями МРТУ 18/210—68 глутамат натрия пищевой должен иметь следующий состав (в %):

Основное вещество, не менее … 94 Влага, ее более …………………1

Хлорид натрия, не более ………… 5 Общей азот, не менее……….. 7,02

Двухступенчатый способ получения.

Его возможно осущест­вить из а-кетоглутаровой кислоты с помощью ферментов транс­амилазы или глутаматдегидрогеназы в результате следующих превращений:

В каждом из этих процессов а-кетоглутаровая кислота иг­рает роль предшественника.

Для осуществления любого из этих превращений необходимы источники а-кетоглутаровой кислоты и соответствующей ферментной системы. Первую из этих задач решают с помощью подбора микроорганизмов, способных продуцировать значитель­ное количество а-кетоглутаровой кислоты из доступных источ­ников сырья. Продуцентами а-кетоглутаровой кислоты могут быть Pseudomonas и Escherickia, а при культивировании продуцента KluyvBrd citrophila а-кетоглутаровай кислота была получена с 57%-ным выходом. Дрожжи рода Candida при выра­щивании на n-парвфинах продуцируют а-кетоглутаровую кислоту совместно с пировиноградной в соотношении 6:1. Экономиче­ский коэффициент процесса биосинтеза достигает 90% от коли­чества потребленных углеводородов.

В роли продуцента фермента трансамидазы могут выступать различные микроорганизмы например Е. coli. Донором амино­групп может быть аспарагиновая кислота или аланин.

Восстановительное эминированме возможно осуществить с по­мощью Pseudomonas (прм использовании Ps. ovalis выход L-глутаминовой кислоты составляет 60%) или Aeromonas, причем некоторые штаммы этих микроорганизмов в качестве субстрата могут использовать D, L-а- оксиглутаровую кислоту, производи­мую химическим синтезом.