23.2.3. Получение аминокислот биотрансформацией

Существующие способы получения аминокислот методом био­трансформации можно разделить на три основные группы:

• ферментативное расщепление D-, L-аминокислот и их про­изводных на оптически активные изомеры;

• прямой ферментативный синтез оптически активных амино­кислот, протекающий без использования энергии АТФ и других макроэргических соединений;

• ферментативный синтез оптически активных соединений, протекающий с использованием живых клеток-продуцентов.

Ферментативное расщепление D-, L-аминокислот и их производ­ных на оптически активные изомеры. Получение L-аминокислот ферментативным гидролизом иллюстрируют данные, представ­ленные в таблице 23.5.

Ферментативный гидролиз N-ацетил-D,L-аминокислот — наи­более распространенный и хорошо изученный процесс получения L-аминокислот из их рацематов (рис. 23.3).

Этот способ интересен возможностью получения целого спект­ра аминокислот при условии замены сырья и использования одного и того же биокатализатора. В последние годы развитие фермента­тивного гидролиза N-ацетил-D -,L-аминокислот связано с создани­ем мембранных реакторов, позволяющих обеспечить длительное и эффективное использование фермента без его предваритель­ной иммобилизации. Известны промышленные способы получе­ния L-лизина и L-цистеина ферментативным гидролизом.

Ферментативный гидролиз эфиров D-,L-аминокислот также мо­жет быть использован для получения L-аминокислот. Так, гидро­лизом метиловых эфиров N-ацетил-D-,L-метионина, D-,L-фенилаланина и D-,L-триптофана с помощью эстераз можно получать соответствующие L-изомеры. Применение эстераз в мембранном реакторе эмульсионного типа позволяет реализовать непрерывное расщепление рацематов.

Несмотря на несомненные преимущества ферментативного рас­щепления оптических изомеров, связанные с его универсальностью, из-за необходимости дополнительной стадии рацемизации непрореагировавшей аминокислоты или ее производных такие процессы считают менее предпочтительными по сравнению с прямым фер­ментативным синтезом оптически активных аминокислот.

Прямой ферментативный синтез оптически активных аминокис­лот. Основные способы получения L-аминокислот методом фер­ментативного синтеза приведены в таблице 23.6.

В связи с производством дипептидного подсластителя аспартама интерес к получению L-аспарагиновой кислоты в последние годы возрос во многих странах.

В 1983 г. фирмой «Танабе Сейаку» (Япония) были получены мутантные штаммы Serratia marcescens и Escherichia coli с высокой аспартазной активностью.

В условиях биотрансформации при использовании целых кле­ток под действием фумаразы может происходить присоединение воды к фумаровой кислоте с образованием L-яблочной кислоты. Инкубация клеток при рН 4,5, температуре 45 °С в культуральной жидкости в присутствии 50 ммоль/дм³ L-аспарагиновой кислоты не только приводит к практически полной инактивации фумаразы, но и существенно (почти вдвое) увеличивает срок работы биоката­лизатора за счет инактивации протеаз. В настоящее время исполь­зование обработанных таким образом и иммобилизованных в каррагинане клеток Escherichia coli ЕАРс-7 в реакторе колонного типа позволяет производить до 100 т L-аспарагиновой кислоты в месяц.

В США предложены эффективные методы получения биоката­лизатора с аспартазной активностью иммобилизацией Escherichia coli ATCC 11303 в полиуретане и полиазетидине.

Другая лиаза (фенилаланинаммиаклиаза) используется для производства L-фенилаланина — второго компонента аспартама.

В этом процессе исходным веществом является ацетаминокоричная кислота, используемая в качестве предшественника фенилпировиноградной кислоты. Обнаружены штаммы, способные превращать относительно дешевую ацетаминокоричную кислоту в L-фенилаланин. Процесс идет в две стадии. На первой стадии ацетаминокоричная кислота превращается в фенилпировиноградную кислоту с помощью ацилазы, на второй — пиридоксалевый фермент в результате трансаминирования превращает фенилпировиноградную кислоту в L-фенилаланин (рис. 23.4).

При использовании 40 мг/см³ биомассы и 10 мг/см³ ацетаминокоричной кислоты выход фенилаланина составляет 94 % после 72 ч инкубации.

Ферментативный синтез оптически активных аминокислот с ис­пользованием живых клеток. Основные источники получения ами­нокислот биотрансформацией с использованием живых клеток представлены в таблице 23.7.

При получении аминокислот в ряде случаев используют метод введения предшественников в процессе ферментации. Так, L-лейцин и L-изолейцин могут быть получены с помощью Corynebac-terium glutamicum из а-кетоизокапроновой и а-кетомасляной кис­лот. В первом случае из 22 г/дм³ субстрата получается 24 г/дм³ лейцина, во втором из 200 моль/дм³ а-кетомасляной кислоты образуется 13 г/дм³ L-изолейцина. Последний может также быть получен при использовании иммобилизованных в каррагинане клеток. При этом в качестве предшественника используется D-треонин, а жизнедеятельность микроорганизмов поддерживается добавлением глюкозы в качестве энергетического субстрата и аэрацией.

Вместо D-треонина можно подавать в реакционную среду лю­бой из промежуточных продуктов.

Ферментация с подпиткой предшественником используется при получении L-триптофана и L-серина. Так, триптофан может быть получен ферментацией с непрерывной подачей питательных веществ и индола или антраниловой кислоты.

Производство серина методом подпитки предшественником основано на использовании гетеротрофных и метилотрофных микроорганизмов. В первом случае используют глюкозу в качестве энергетического субстрата и глицин в качестве предшественника серина, во втором — соответственно метанол и глицин.

Аналогичным образом наличие в культуральной жидкости предшественника L-пролина L-глутаминовой кислоты позволяет получить в культуральной жидкости пролин. L-глутамин может быть получен из L-глутаминовой кислоты с помощью глутамин-синтетазы.

В 50-е годы XX в. японскими учеными был открыт вид микро­организмов Corynebacterium glutamicum, обладающий способностью к сверхсинтезу глутаминовой кислоты. Углубленное изучение этой группы микроорганизмов показало, что при направленной селек­ции можно получить мутанты, обладающие также способностью к сверхсинтезу L-лизина. Поэтому большинство продуцентов L-лизина в настоящее время можно отнести к роду бактерий Согупеbacterium. Это открытие послужило основой создания крупнотон­нажного производства L-аминокислот.

Известно, что синтез аминокислот в клетке ведется очень эко­номно и целенаправленно, под контролем специальных регулиру­ющих систем. Регуляторный контроль обычно осуществляется по принципу обратной связи на уровне начального фермента или ферментов данного специфического пути образования метаболи­та. В случае значительного повышения уровня конечного продук­та (например, L-лизина) включается механизм регуляции и один из ферментов в цепи последовательных превращений блокирует­ся, синтез прекращается. Цель этого регулирования — предотвра­тить избыточное образование и накопление данного метаболита, потребность организма в котором в настоящий момент полностью удовлетворяется. Но такой безупречный ход синтеза возможен лишь у микроорганизмов, не имеющих нарушений и дефектов в этом механизме. В природных условиях такие нарушения достаточно редки, но все же встречаются. Например, найдено немало природ­ных микроорганизмов, обладающих способностью к сверхсинтезу глутаминовой кислоты, аланина, валина. В то же время таких про­дуцентов по лизину, гомосерину, треонину и некоторым другим аминокислотам в природных условиях найдено не было. Для полу­чения промышленных продуцентов пошли по пути получения му­тантов, имеющих генетический дефект регуляторного контроля про­цесса биосинтеза этих аминокислот, а позднее использовали генномодифицированные микроорганизмы-продуценты. Очевидным преимуществом этого способа является то, что микроорганизмы образуют аминокислоты в биологически активной L-форме, обра­зование аминокислот в D-форме является редчайшим исключени­ем. Это значительно облегчает очистку и выделение аминокислот.

В биотехнологическом производстве аминокислот в качестве сырья можно использовать как продукты химии и нефтехимии, так и отходы сельского хозяйства и других отраслей. Долгое время для получения аминокислот применяли исключительно углеводосодержащее сырье: глюкозу и гидролизаты крахмала. Использова­ние свекловичной или тростниковой мелассы как основного для биосинтеза углеводного сырья, содержащего одновременно большое количество сахара и все необходимые факторы роста, доступ­ного по цене и запасам во многих районах земного шара, позволи­ло в 50-е годы XX в. организовать крупнотоннажное микробиоло­гическое производство важнейших аминокислот. Несмотря на об­щее удорожание различных видов сырья, в том числе и мелассы, она по-прежнему остается одним из основных сырьевых ресурсов биотехнологических производств.

В 70-е годы XX в. для получения аминокислот комбинирован­ным и микробиологическим методами стали широко применять продукты химии и нефтехимии, что позволило организовать круп­номасштабное производство аминокислот для кормовых и пище­вых целей. Применение химического сырья для биосинтеза обес­печивало возможность стандартизации процесса, повысило выход и упростило выделение аминокислот. Так, способы получения ли­зина и глутамата натрия из ацетатного сырья отличались высоки­ми технологическими показателями (содержание аминокислоты в культуральной жидкости, выход готового продукта). Однако рез­кое увеличение цен на это сырье ограничило его применение для биосинтеза аминокислот.

Из нефтехимических источников сырья для биосинтеза амино­кислот в настоящее время привлекают внимание спирты, в том числе этанол и метанол. Однако использование их сдерживает ряд технологических трудностей, и в первую очередь отсутствие высо­копродуктивных микроорганизмов. Исследования в этом направ­лении продолжаются.

В последние годы возрастает роль дешевого растительного сы­рья для микробиологического производства аминокислот. В Япо­нии, Китае и странах Юго-Восточной Азии работают предприятия по синтезу аминокислот генномодифицированными микроорга­низмами, выращиваемыми на гидролизатах различных сельскохо­зяйственных культур.

Типовая схема технологического процесса получения аминокис­лот микробиологическим способом представлена на рисунке 23.5.

Создание и использование в рационе питания БАД, содержа­щих не только каротиноиды, но и убихиноны, полиненасыщенные жирные кислоты, некоторые фосфолипиды и витамины группы D, позволяют повысить уровень адаптационной защиты организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды и сни­зить риск развития злокачественных новообразований и ряда дру­гих опасных заболеваний. Доказательством этому служит все более пристальное внимание ученых многих индустриально развитых стран к этим биологически активным веществам липидной природы, и, как следствие этого, разработка и создание технологий, позволя­ющих получать каротиноиды, убихиноны, полиненасыщенные жир­ные кислоты, фосфолипиды и витамины группы D методами хими­ческого синтеза, экстракцией из животных и растительных тканей или биотехнологическими методами. Последние, по мнению боль­шинства специалистов, являются наиболее перспективными.

Российскими специалистами предложены биотехнологические методы получения высших гомологов убихинона из липидов дрожжей рода Candida и из биомассы бактерий Gluconobacter. Для одновременного получения эргостерина и убихинона предложены способы использования дрожжей рода Candida и некоторых дру­гих микроорганизмов.

Сотрудниками ГосНИИсинтезбелок разработана технология комплексной переработки биомассы гриба Blakeslea trispora, позво­ляющая получать в едином технологическом процессе несколько ценных целевых продуктов: β-каротин, убихиноны, эргостерин, фос­фолипиды, полиненасыщенные жирные кислоты. Принципиаль­ная технологическая схема процесса представлена на рисунке 24.4.

Установлены следующие закономерности культивирования гри­ба BL trispora, обеспечивающие максимальное накопление отдель­ных компонентов биолипидного комплекса:

• максимальное накопление эргостерина отмечено на 65-й час совместной ферментации (+) и (—) штаммов, а максимальное на­копление убихинонов — на 45-й час;

• внесение в среду культивирования сквалена оказывает поло­жительное влияние на накопление убихинонов и эргостерина, в этом случае возможно получение биомассы с содержанием убихи­нонов 3,48 мг/г и эргостерина около 2 %;

• для получения стабильных водных растворов возможно ис­пользование смеси с содержанием убихинонов 40 %.

По сравнению с наиболее известными ранее разработанными схе­мами получения комплекса биологически активных веществ в техно­логическую схему внесены некоторые изменения, так, предложено:

• проведение процесса экстракции при температуре 55 °С в три ступени, на первой и второй ступенях использование в качестве экстрагента ацетона, на третьей —- этанола при соотношении биомасса: экстрагент 1:3,5; 1:2,0 и 1:1,5 на первой, второй и третьей ступенях соответственно. Время экстракции ацетоном — не более 30 мин, этанолом — 65 мин;

• использование на стадии кристаллизации β-каротина ацетона в качестве растворителя, проведение процесса при 55 °С в течение 18 ч при соотношении липиды: ацетон — 1:3, а процесса пере­кристаллизации — в этаноле при 20 °С и соотношении кристал­лы : этанол 1:4;

• использование на стадии выделения фосфолипидов соот­ношения липиды: ацетон —1:5, проведение процесса в течение 20 мин при 10 °С;

• использование на стадии омыления при 67 °С в течение 50 мин в качестве среды смеси нейтральные липиды: ацетон: во­да : гидроксид калия в соотношении 1:4,35:1,37:0,88;

• использование гексана на стадии экстракции неомыляемой фракции в качестве экстрагента, проведение экстракции в три ступени с соотношением фаз нейтральные липиды: ацетон: во­да : гексан — 1:5,1:4,9:3,5;

• использование на стадии кристаллизации эргостерина из неомыляемой фракции гексана, проведение процесса кристалли­зации при 20 °С и соотношении неомыляемая фракция: гексан 1:5. Проведение перед стадией кристаллизации дополнительной очистки неомыляемой фракции 10%-м раствором ацетона в гекса- не, позволяющей увеличить чистоту кристаллов;

• использование на стадии кристаллизации убихинонов этано­ла при 20 °С и концентрации убихинонов в этаноле 10 %.

Разработанная технологическая схема позволяет получать из 100 кг сухой биомассы гриба Bl. trispora следующие продукты: β-каротин (2,5 кг), фосфолипиды (8,2 кг), жирные кислоты (36,2 кг), эргостерин (1,2 кг), суммарные убихиноны (0,5 кг). На основании частичной реализации предложенной технологической схемы в настоящее время выпускаются биологически активные добавки к пище «Липидовит» и «Кютенвит».