23.2.2. Получение аминокислот из белковых гидролизатов и автолизатов

Для получения аминокислот могут быть использованы отходы мясоперерабатывающей промышленности (кератиновое сырье, кровь и т.д.), яичный белок, казеин молока, различные отходы переработки растений, содержащие белки (клейковина пшеницы, соевый шрот и т. д.), белки микроорганизмов (кормовые и пище­вые дрожжи). При переработке этого сырья все аминокислоты пе­реходят в гидролизат, и для выделения отдельных аминокислот требуется сложная многостадийная очистка. Кроме того, сырье весьма дефицитно и дорого, поэтому из-за высокой себестоимо­сти получаемых этим способом аминокислот его применение ограничено.

Для гидролиза сырья используют кислоты, щелочи и фермен­ты. При кислотном гидролизе белков большая часть триптофана разрушается, цистеин окисляется до цистина, серии и треонин распадаются. При щелочном гидролизе триптофан сохраняется несколько лучше, но практически полностью разрушаются серин, аргинин и цистеин. При ферментативном гидролизе бел­ков аминокислоты не разрушаются, но требуется сложная подго­товка сырья: белок должен находиться в растворимой или другой легкодоступной форме. Гидролиз редко идет до конца, посколь­ку большинство протеолитических ферментов не проявляют сродства к разрыву всех пептидных связей в субстрате, поэтому в гидролизате накапливается сложная смесь аминокислот и пепти­дов различной молекулярной массы, кроме того, в гидролизатах остается сам фермент или продукты его частичного разрушения, что также осложняет процесс выделения из этой смеси амино­кислот.

Несмотря на трудности получения отдельных аминокислот из гидролизатов, это все же весьма важный источник получения их в смеси.

В нашей стране подобным способом вырабатывают небольшие партии высокочистых аминокислот в основном для научных це­лей, а также автолизаты и ферментолизаты дрожжевых биомасс для пищевой промышленности.

В основе технологического автолиза дрожжей лежат процессы подавления роста клеток и активации цитоплазматических деполимераз. При блокировке роста автолиз клеточных стенок проис­ходит слабо и значительная часть нерастворенного материала мо­жет быть отделена в конце процесса в виде крупных структурных фрагментов. Активация цитоплазматических деполимераз приво­дит к накоплению продуктов гидролиза белков и нуклеиновых кислот. За счет этого в заключительной фазе автолиза происходит снижение рН реакционной среды, стабилизация рН свидетель­ствует об окончании процесса. Широко применяемым методом контроля является также определение содержания свободного аминного азота, нарастающего в процессе протеолиза.

Технологический автолиз пекарских дрожжей проводят при температуре 45...50 °С в присутствии плазмолизирующих агентов: толуола, хлороформа, этанола, поваренной соли и др. В суспензии биомассы создают рН 5,5—6,5. В ходе автолиза чаще всего рН не регулируют: при естественном изменении рН чередуются опти­мальные условия для действия различных деполимеризующих ферментов, что повышает эффективность процесса в целом. Со­держание сухих веществ в суспензии может быть от 1 до 20 %, сни­жение концентрации биомассы в этих пределах приводит к интен­сификации автолиза. Продолжительность автолиза составляет 15—30 ч, а после предварительной механической дезинтеграции биомассы — 5—6 ч.

Отечественными учеными разработан способ комплексной пе­реработки биомассы пекарских дрожжей на основе автолиза 20%-й суспензии дрожжей в присутствии 13 % толуола. Продол­жительность процесса при 45...50 С 15—20 ч. Последующее фрак­ционирование автолизата включает отделение клеточных стенок дрожжей центрифугированием, обесцвечивание жидкой фазы ав­толизата, удаление нуклеиновых соединений и пептидов сорбцией на ионите ИА-1p в ОН ^¯ -форме, сорбцию аминокислот из очи­щенного раствора предыдущей стадии на катеоните КУ-2×8 и их последующую элюцию раствором аммиака. Получаемая смесь аминокислот содержит все незаменимые и заменимые аминокис­лоты в соотношениях, характерных для высокопитательных бел­ковых продуктов. Содержание свободных аминокислот составляет около 70 % белка автолизированной биомассы, около 25 % белка гидролизовано до низших пептидов (500—700 Да). По данной схе­ме из 50 кг дрожжей с влажностью 75 % получают 2—3 кг смеси аминокислот, 0,3—0,5 кг нуклеиновых компонентов и около 6 кг клеточных стенок, из которых можно выделить 35—45 г эргостерина.

При получении дрожжевых автолизатов и выделении из них продуктов пищевого и медицинского назначения вместо токсич­ного толуола в качестве мембранотропных агентов используют этанол, а также смеси карбоновой кислоты [например, пропионовой (0,4 %)] и этилацетата (1,5 %), обеспечивающие стерильность процесса и высокий выход целевых продуктов (L-аминокислот и пептидов). Из нетоксичных агентов лучшим активатором протеолитических ферментов является этилацетат при температуре 50...55 °С, а из нуклеазных — этанол при 60...65 °С.

Дрожжевой автолизат, содержащий смесь метаболитов, обла­дает способностью индуцировать автолиз интактной дрожжевой биомассы, что позволяет использовать его в качестве затравки при непрерывном процессе автолиза.

Проведение автолиза в присутствии ионов Са²⁺ и Mg²⁺ дает возможность получать автолизаты с пониженным содержанием меланоидных компонентов, которые применяются без предвари­тельной очистки.

Скорость и эффективность автолиза зависят, с одной сторо­ны, от физико-химических условий ведения процесса, селективно оптимальных для стадии как индукции автолиза, так и фермента­тивного гидролиза клеточных биополимеров. С другой стороны, эффективность саморастворения клеток зависит от количества и активности клеточных гидролаз. Как правило, интенсивная де­струкция клеток микроорганизмов заканчивается через 4—6 ч в результате ингибирования деполимераз конечными продуктами реакций.

Поэтому наиболее важными для повышения эффективности ав­толиза являются проблемы стабилизации ферментов автолитического комплекса. Решение их позволило бы пролонгировать время интенсивного гидролиза клетки и расширить диапазоны физико-химических параметров каталитической активности гидролаз.

По данным исследований специалистов Института микробиоло­гии РАН, интенсификацию процессов автолиза дрожжей Sacchammyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe можно вызвать внесени­ем в подкисленные клеточные суспензии (рН 3—3,5) химического аналога аутоиндуктора автолиза — спиртового раствора олеиновой кислоты (С_{18: 1}) в концентрациях 0,25—4 мкмоль/см³, оптимально — 1,12 мкмоль/см³ (объемная доля спирта в суспензии 2 об. %).

Подкислением суспензии воспроизводили естественные условия в развивающейся дрожжевой культуре и обеспечивали лучшую инкорпорацию молекул (С_{18: 1}) в клеточные мембраны, что вызыва­ло их дестабилизацию и индуцировало автолиз клеток. Суспензию дрожжевых клеток термостатировали при температуре 40...45 °С в течение 30 мин (стадия индукции). Затем рН суспензии доводили до 6,8—7,2 раствором NaOH, клетки термостатировали при темпе­ратуре 50... 53 °С в течение 6—8 ч с подтитровкой суспензии до за­данных значений рН 6,8—7,2 (стадия автолитического разруше­ния клеток). Достигаемая глубина гидролиза для дрожжевых сус­пензий обоих видов составила 42,2—43,5 % по результатам умень­шения массы сухих клеток (МСК), как указано в таблице 23.2.

Перспективным источником белка являются избыточные пив­ные дрожжи, выход которых составляет 0,1—0,2% массы пива, они могут быть также автолизированы по описанной схеме.

Лизис дрожжей с использованием ферментных препаратов и различных мультиэнзимных композиций предоставляет более ши­рокие возможности для получения продуктов различного состава, чем автолиз. Применение ферментных препаратов специфичес­кого действия позволяет быстро удалить клеточную стенку и вы­делить из освободившихся протопластов продукты различной степени гидролиза в зависимости от целевого назначения. Для получения недеградированных цитоплазматических компонентов следует использовать биомассу с низкой автолитической актив­ностью.

Способы получения препаратов глубокого расщепления осно­вываются на сочетании автолиза дрожжей и их лизиса препарата­ми литического или протеолитического действия. Для активации протеолиза дрожжей используют растительные, животные и мик­робные протеазы, которые могут быть неспецифическими по от­ношению к дрожжевому белку, но в сочетании с автолитическими протеазами дрожжей дают хороший эффект. Например, Проназа Е, папаин, пепсин, Протосубтилин нейтральный в соотношении с изолированным белком пекарских дрожжей 1:1000 гидролизуют его не более чем на 4 %, а добавление этих препаратов в том же со­отношении к белку автолизирующихся дрожжей через 5 ч после начала этого процесса позволяет спустя еще 1 ч получить глубину гидролиза белка 95 %. В контроле этот уровень достигается лишь после 20 ч автолиза.

Амилопроторизин, содержащий комплекс протеаз: α-амилазу, экзо-β-глюканазу, ксиланазу, эффективно воздействует на дрож­жевую клетку, переводя макромолекулярные структуры клетки в мономеры. При этом ферменты препарата осуществляют не толь­ко растворение белков протоплазмы, но и глубокую деполимери­зацию в результате синергического действия трудногидролизуемых полисахаридов клеточных стенок.

Оптимальная дозировка препарата для 6-часового гидролиза 15 ед. ПС/г дрожжей, при этом в растворимое состояние перево­дится 80% белка, высвобождается 48—52% аминокислот, обра­зуется около 50 мг/г аминного азота и 11 % редуцирующих угле­водов.

Во ВНИИПБТ исследовали степень гидролиза микробного белка различного происхождения и установили, что наиболее легко гидролизуемыми являются кормовые и остаточные пив­ные дрожжи. В результате воздействия Амилопроторизина на дрожжевой белок этих микроорганизмов образуется 60—61 % свободных аминокислот, а при гидролизе пекарских дрожжей — 41%.

Технологическая схема гидролиза дрожжевой биомассы Амилопроторизином с получением биологически активной аминокис­лотной добавки: Протамин А — сухой фугат и Протамин К — су­хой ферментолизат, представлена на рисунке 23.2.

Биохимический состав опытных партий Протаминов А и К, полученных на основе ферментолиза биомассы пекарских и пив­ных дрожжей, представлен в таблице 23.3. Энзиматическому гид­ролизу была подвергнута большая часть белков клетки (76—81 %), при этом высвободилось 46—49 % аминокислот.

Содержание нуклеиновых кислот во всех препаратах Протамина в результате гидролиза дрожжевых клеток ферментативным комплексом препарата Амилопроторизин было снижено более чем в десять раз (с 5 % до 0,43 —0,41 %).

Препарат Протамин пищевой наряду с легкоусвояемыми про­дуктами гидролиза высокомолекулярных полимеров дрожжевой клетки (аминокислоты, редуцирующие углеводы) содержит бога­тый комплекс витаминов (табл. 23.4) и рекомендуется для введе­ния в рецептуры новых продуктов питания с повышенной биоло­гической ценностью.

С использованием препарата Лизосубтилин возможно получе­ние белково-витаминного обогатителя пищи из гидролизных дрожжей рода Candida и дрожжей спиртового производства. Кор­мовые дрожжи с влажностью 75—90 % нагревают до температуры 46...50°С. Вносят Лизосубтилин в количестве 0,2—0,5% сухого вещества дрожжей, проводят гидролиз в течение 20—30 ч при постоянной температуре и перемешивании. Затем непрогидролизованные остатки клеток отделяют сепарацией, а жидкую фазу высушивают. Сухой продукт представляет собой порошок соло­менно-желтого цвета с приятным запахом. Содержание аминного азота составляет 4,3 %, около половины аминогрупп принадлежит свободным аминокислотам, среди которых преобладают аланин, лизин, лейцин (соответственно 16,0, 15,7 и 12,4 %).

Дрожжи спиртового производства обладают заметной автолитической активностью, причем оптимальные условия автолиза и лизиса Лизосубтилином совпадают, что позволяет вести процесс при постоянных значениях рН и температуры (рН 6,3—6,8, тем­пература 50...55°С). При дозе препарата 0,1 % АСБ дрожжей выход растворимых форм азота и углеводов возрастает в 2—2,5 ра­за (по сравнению с автолизом), через 6 ч в жидкую фазу ферментолизата переходит около половины азотистых соединений и треть углеводов. Выход аминного азота составляет около 3 % АСБ дрожжей.

Применение ферментных препаратов не снижает пищевой ценности и усвояемости высвобождаемого белка, аминокислот и редуцирующих веществ.

У нас в стране на основе автолиза прессованных хлебопекарных дрожжей Saccharomyces cerevisiae были разработаны аминокислот­ные препараты «Александрина» и «Элита» в виде растворов, паст и порошков. В состав препаратов входят аминокислоты, углеводы, витамины, макро- и микроэлементы биогенного происхождения, необходимые для жизнедеятельности человека. Добавки не обла­дают мутагенным действием, не содержат холестерина и усваива­ются человеком на 90 %. Препараты добавляют в хлебобулочные и кондитерские изделия, безалкогольные напитки и овощные обе­денные консервы, напитки, желе, продукты детского питания.

Специалистами российской фирмы «БИТРА» разработаны на­туральные БАД серии «Нагипол», созданные на основе автолизатов пивных дрожжей.

Пищевая ценность и биологическая активность БАД «Нагипол» определяется содержанием сбалансированного комплекса 18 ами­нокислот (включая все восемь незаменимых), пептидов, витами­нов группы В, витаминов Е, F, К и наиболее важных эссенциальных макро- и микроэлементов: фосфора, калия, магния, железа, цинка, меди, хрома и др.

При приеме БАД «Нагипол» суточная потребность организма во всех вышеперечисленных биогенных соединениях восполняет­ся на 20—50 % и более.

Оценка эффективности БАД «Нагипол», проведенная в рамках программы медико-экологической реабилитации населения, про­живающего на экологически неблагополучных территориях, со­вместно с ГНИЦ профилактической медицины Минздравсоцразвития РФ, показала, что в результате проведения 3—6-месячной профилактики при ежедневном приеме препаратов в рекомендуе­мой дозе среди детей и взрослых в 1,5—2 раза снизилась распро­страненность показателей алиментарных дефицитов: хронических атрофических нарушений, признаков вторичных иммунодефицитов, снизился уровень психоэмоционального напряжения.

Включение ферментолизатов в состав пищевых продуктов улуч­шает питательную ценность последних; задерживает их порчу; при­дает им желательную структуру, растворимость; способствует полу­чению пенообразующих, свертывающих, эмульгирующих свойств; предупреждению нежелательных взаимодействий; удалению по­роков вкуса, запаха, токсичных и ингибирующих веществ.

Дрожжевые ферментолизаты и автолизаты обладают способно­стью придавать пищевым продуктам привкус мяса (или усиливать такой вкус), поэтому их широко используют в пищевой промыш­ленности для приготовления супов, соусов, подлив и приправ, а также для придания вкуса таким продуктам, как чипсы. С помощью белковых гидролизатов можно составлять низкокалорийные бел­ковые рационы, обеспечивающие контролируемое уменьшение мас­сы тела, не приводящие к каким-либо патологическим последст­виям. Однако белковые гидролизаты имеют сравнительно ограни­ченное применение в пищевой промышленности, прежде всего из-за горького вкуса пептидов, образующихся в процессе гидролиза.

Российскими исследователями показана целесообразность при­менения иммобилизованных ферментов, например Протосубтилина, для гидролиза белкового сырья, а также пептидов неполных белковых гидролизатов с целью получения смеси L-аминокислот, не содержащей пептидов.

Полученные гидролизаты белков не обладают горьким вкусом, что является одной из важнейших характеристик белковых фер­ментативных гидролизатов для применения в питании человека.