3.2. Метод оттенения металлами.

Если пленка, образующая реплику, имеет равномерную толщину и одинаковый состав, то она, естественно, будет лишена контраста при просмотре в электронном микроскопе. Такой контраст реплике можно создать, напыляя под острым углом электроноплотное вещество, например, тяжелый металл. Атомы этого металла скопятся на той стороне поверхностных контуров, которая ближе к источнику напыления, а их количество на стороне, удаленной от напыления, будет меньше. Здесь можно провести аналогию с предметом, который находится под яркими лучами солнца: такой предмет освещен со стороны, обращенной к солнцу, а его противоположная сторона отбрасывает тень. Поэтому такой процесс напыления известен как «оттенение».

Если известны угол напыления θ и длина тени l, которую определяю, измеряя ее на негативном отпечатке, то высоту объекта (h) можно вычислить по формуле:

h = lxtgθ.

Нанесение реплики и оттенение можно проводить за один прием, если на поверхность объекта одновременно напылять платину и углерод.

3.3. Метод замораживания-скалывания (замораживании-травления).

Этот метод впервые был предложен Стиром. Замораживание-скалывание – это чисто физический метод, и в нем полностью исключены как химические, так и структурные изменения в ткани, которые обусловлены химической фиксацией, обезвоживанием, заливкой и резкой. Поскольку из ткани не удаляются никакие вещества, не может происходить ее сморщивания.

При обычном замораживании материала свободная вода кристаллизуется в виде включений различной величины в цитоплазме клеток и межклеточных пространствах. При этом возникают повреждения органелл, особенно если материал предварительно не был фиксирован в растворе глутарового альдегида, поэтому перед замораживанием необходимо провести фиксацию материала. Наилучшие результаты замораживания биологического материала без повреждения тонких структур достигаются путем увеличения скорости замораживания и применения криопротекторов.

Основное действие криопротекторов – предварительное замещение воды в объекте. Таким образом криопротекторы ослабляют эффект кристаллизации, изменяя её характер, препятствуют слипанию и денатурации макромолекул, способствуют сохранению целостности мембран клеток. Среди криопротекторов наиболее известны глицерин, ацетон, спирт, диметилсульфоксид, сахара, которые способны проникать в клетку, и некоторые полимерные соединения (поливинилпирролидон, полиэтиленоксид и др.), не проникающие в неё. После пропитывания ткани криопротектором ткань подвергается быстрому замораживанию жидким азотом (-196°С). В результате клетки не повреждаются и выживают независимо от своего происхождения.

После извлечения из жидкого азота объект раскалывают при помощи тонких щипцов, скальпеля и легкого молоточка. Полученные поверхности раскола затем обрабатывают с целью получения реплик (с поверхности снимается отпечаток в виде тонкой плёнки углерода, коллодия, формвара и др., повторяющий рельеф поверхности и рассматривается в просвечивающий электронный микроскоп). Либо поверхности раскола предварительно высушивают и напыляют для исследования в растровом (сканирующем) электронном микроскопе.

Для получения реплик поверхность разлома подвергается действию вакуума (10^-6 -10^-7 мм рт.ст.). По мере того как вода, перешедшая в стекловидную форму, возгоняется, поверхность разлома как бы «протравливается», так что на ней рельефно выделяются органеллы. На «протравленную» поверхность напыляется покрытие из платины или углерода. Таким образом и формируется реплика исследуемой поверхности. После напыления ткань согревают в дистиллированной воде, и реплика всплывает. Следы органических веществ, остающиеся на реплике, удаляются с помощью трипсина с последующей обработкой серной кислотой или щелочью. После тщательной промывки дистиллированной водой реплику помещают на сетку – теперь она готова для просмотра в электронном микроскопе.

Данный метод позволяет обнаружить такие детали, которые не выявляются при использовании других методов. Разлом, следуя по линии наименьшего сопротивления, имеет тенденцию проходить по естественным поверхностям внутри клеток. Этими естественными поверхностями являются мембраны таких органелл как ядро, аппарат Гольджи, митохондрии. Следовательно, открываются поверхности этих органелл, которые можно детально изучать.

Разрешение, получаемое методом замораживания-скалывания, зависит от вида тяжелого металла, используемого для получения реплики. Так, при получении платино-углеродной реплики разрешение ограничено 20-30Å.