2.4. Заливка материала.

После обезвоживания следует подготовка материала к заключению в заливочную среду. Для этого материал помещают в среду, которая одинаково хорошо смешивается и со спиртом, и с заливочной средой.

В качестве заливочной среды могут использоваться, например, парафин, полиэтиленгликоль, парапласт, желатин и др. Парафин – воскоподобное вещество, смесь предельных углеводородов состава С18Н38-С35Н72. tпл 40-65 °С; плотность 0,880-0,915 г/см3 (15 °С). Получают главным образом из нефти. Парапласт – гранулированный специализированный гистологический парафин (торговое наименование – Paraplast Plus) состоит из очищенного парафина и пластичного полимера с регулярным молекулярным весом, дважды отфильтрован и не имеет посторонних включений. Благодаря содержанию диметил сульфоксида (ДМСО) Парапласт Плюс быстро проникает в обработанную ткань (имеет высокую текучесть) и предназначен для заливки образцов с целью дальнейшего получения тонких – 2 микрона – серийных срезов. Диапазон температуры плавления – 55 – 57 С (оптимально - 56 С). Нельзя нагревать выше 62 С.

С целью подготовки материала к заливке кусочки из 100% помещают в смесь ксилола с абсолютным спиртом (1:1). Далее материал переносят в чистый ксилол (две смены). Из ксилола кусочки переносятся в «кашу» - смесь парафина (парапласта) и ксилола помещаются в термостат, отрегулированный на 37º С. С «каши» начинается этап пропитки материала парафином, что достигается постепенным замещением ксилола на парафин. Из «каши» кусочки переносятся в расплавленный парафин и помещаются в термостат, отрегулированный на 2-3 градуса выше точки плавления парафина (обычно на 60º С). Затем кусочки переносятся во второй парафин. Все манипуляции по переноске кусочков в парафин проводятся пинцетом, нагретым над пламенем горелки. После второго парафина проводят заливку материала в новый, третий, заливочный парафин. Для этого пропитанные в парафине кусочки выкладывают в специальные формочки и заливают расплавленным в термостате парафином. Дают остыть.

2.5. Работа на микротоме.

Для получения гистологических срезов применяют специальные приборы, называемые микротомами. Полученный ранее парафиновый блок наклеивают на специальную деревянную колодку, срезают лишний парафин и устанавливают в микротом. Микротомы позволяют получить срезы разной толщины; хорошей для светомикроскопического среза является толщина 3-4 мкм.

Полученные срезы при помощи смеси белка с глицерином прикрепляют к предметным стеклам. Вся дальнейшая работа связана с подготовкой срезов к окрашиванию. Целью окрашивания является более отчетливое выявление компонентов клеток и тканей.

Предметные стекла.

Предметные стекла должны имеют толщину 1,0 – 1,2 мм. Толщина стекла порядка 1 мм примерно соответствует длине световой волны, что обеспечивает низкие интерференцию и дифракцию волн, слабое отклонение светового пучка. Это способствует получению на подобных стеклах препаратов высокого оптического качества. Кроме того, постоянство толщины стекла по всей длине препарата снижает до минимума необходимость подстройки фокусного расстояния микроскопа, что особенно важно при микроскопии на иммерсионном объективе. Кроме того, предметные стекла не должны быть окрашены. Имеющее окраску стекло искажает оттенки окраски клеток и клеточных элементов в препарате, что особенно не желательно, когда тонкие оттенки цветов являются самым существенным фактором идентификации и диагностики.

Предметные стекла отличаются по состоянию бокового ребра – резанные или с зашлифованным краем. Стекла с зашлифованным краем используют при микроскопировании объектов, при котором блики на срезанном боковом ребре могут помешать идентификации объекта. Также стекла отличаются наличием или отсутствием матового окошка на поверхности стекла, использующегося для маркировки препарата. Размер окошка – 26 х 20 мм.