Лабораторная работа №1

Приготовление пробиотических заквасок, физико-химический и микробиологический контроль их качества

Цель работы: освоить технологию приготовления заквасок и методы контроля их качества.

Материальное обеспечение: бактериальные закваски (2-3 видов), молоко цельное или обезжиренное, автоклав или ки­пятильник с текучим паром, колбы на 500 см³ с пробками, термо­метры, спиртовки, пергамент, термостаты на 30, 40 - 45 °С, сте­рильные пробирки, пипетки на 10 и 1 см³, дезраствор, микроскоп, среда Кесслер по 50 см³, 0,1 моль/дм³ раствор NaОН, фенолфта­леин, раствор с массовой долей питьевой соды 10 %, раствор с массовой долей КОН 40%, дистиллированная вода, предметные стекла, бактериологические петли, краски для окрашивания мик­робиологических препаратов, фильтровальная бумага.

Теоретические сведения

Заквасками называют чистые культуры или смесь культур микроорганизмов, используемые при изготовлении кисломолочных продуктов.

Бактериальные культуры, которые в западноевропейской технической литературе буквально называются «стартовыми культурами», а в отечественных источниках - «заквасками», ис­пользуются в производстве кисломолочных продуктов, сыра и кисло-сливочного масла. Закваски вносятся в подготовленное сырье, создаются благоприятные условия для роста и размноже­ния внесенных культур, в результате чего снижается активная кислотность (рН), изменяется консистенция, появляются специ­фический вкус и аромат, то есть получается продукт с заданными свойствами.

Закваски классифицируются в зависимости от температуры и состава микрофлоры. В зависи­мости от температуры закваски подразделяются на следующие типы, при которой бактериальная культура име­ет максимальную скорость роста и размножения:

• мезофильные бактерии с температурой развития от 20 до 30 °С;

• термофильные бактерии с температурой развития от 40 до 45 °С.

Рисунок 1. – Микроскопическая картина молочнокислых бактерий

Закваски могут содержать как один бактериальный штамм, так и несколько.

В приложении 1 приведены наименования штаммов заквасок в соответствии с указанной группой.

По составу микрофлоры основные закваски, применяемые в молочной промышленности, подразделяются на 3 группы: бакте­риальные, грибковые и смешанные (табл.1)

В специальных научно-производственных лабораториях выделяют штаммы молочнокислых микроорганизмов, изучают их свойства, селекционируют, составляют и получают закваски.

В цехах по производству заквасок готовят сухой и жидкий бактериальные концентраты, маточные закваски в виде сухих и жидких заквасок, а также получают натуральные и сухие кефир­ные грибки (зерна).

Сухой бактериальный концентрат чаще вырабатывают трех видов: мезофильных молочнокислых стрептококков, термофильных молочнокислых стрептококков и ацидофильных молочнокислых палочек. Концентрат содержит от 150 до 300 млрд клеток в 1 г.

Продолжительность свертывания молока при внесении од­ной порции концентрата на 1 дм³ молока при оптимальной темпе­ратуре составляет: у мезофильных стрептококков 4,0 - 5,5 ч, у тер­мофильных молочнокислых стрептококков 3,0 - 4,5 ч, а у ацидо­фильных палочек 2,5 - 3,5 ч. Срок хранения концентрата при тем­пературе 3 - 10 °С - 8 мес. со дня выработки.

Жидкий бактериальный концентрат готовят из ме­зофильных молочнокислых стрептококков.

Концентрат разливают во флаконы по (5 - 0.5) см³ (полпор­ции) и по (10 - 0,5) см (порция), укупоривают, охлаждают до температуры от -8 до -5 °С и хранят не более двух месяцев со дня выработки. Жидкий бактериальный концентрат содержит не менее 150 млрд клеток в 1 см³.

Сухие закваски приготовляют на основе бактериальной массы (из бактериального концентрата) или высушиванием комби­наций культур бактерий в защитной среде.

Продолжительность свертывания молока (при внесении од­ной порции закваски для творога и сметаны на 2,0 - 2,5 дм³, ос­тальных заквасок на 100 см³ молока) составляет для закваски из бактериальной массы 5 - 9 ч, для закваски из комбинации культур 16- 18ч.

Количество молочнокислых бактерий в 1 г сухой закваски составляет 10⁷ - 10⁸.

Жидкие закваски готовят на стерильном обезжиренном или цельном молоке. Молоко стерилизуют в течение 10-15 мин при температуре 121 °С, охлаждают до (37 ± 1) °С и для проверки на стерильность термостатируют при этой температуре в течение 2 суток. Перед заквашиванием молоко контролируют микроскопированием окрашенного препарата. При просмотре не менее чем в 10 полях зрения микроскопа должны отсутствовать вегетативные клетки и споры.

После этого в молоко вносят комбинацию культур и выдер­живают его при оптимальной температуре развития до образова­ния сгустка. Закваску фасуют в стеклянные флаконы по 20, 50 и 100 см³, флаконы укупоривают и маркируют (этикетируют). Жид­кие закваски имеют срок годности: 10 суток при 3 - 8 °С и 5 суток при комнатной температуре хранения.

Кефирные грибки (зерна) представляют естественную симбиотическую закваску для кефира. В них входят молочнокис­лые стрептококки, палочки, дрожжи и уксуснокислые бактерии (рис. 1).

Процесс получения натуральных кефирных грибков вклю­чает подготовку молока, культивирование кефирных грибков, от­деление, фасование, укупоривание, маркирование и хранение. Для культивированных кефирных грибков используют обезжи­ренное молоко, пастеризованное при температуре 92 - 95 °С в те­чение 20 - 30 мин, в которое помещают грибки в соотношении 1:20. Выращивание проводят при температуре 18-22 °С. Еже­дневно молоко меняют, т. е. грибки заливают свежими порциями питательной среды. Молоко, в котором культивировались кефир­ные грибки, представляет собой уже культуральную кефирную закваску (грибковую), содержащую ту же микрофлору, что и ке­фирный грибок.

По мере роста грибков 1 - 2 раза в неделю их отделяют от закваски, фасуют порциями в стерильные флаконы, заливают обезжиренным молоком или сывороткой. Срок хранения кефир­ных грибков составляет 10 дней при температуре 8 - 10 °С.

Сухие кефирные грибки получают из натуральных (живых) кефирных грибков путем высушивания в защитной среде.

Продолжительность сквашивания молока при соотношении грибка и молока 1:40 и температуре 18 - 22 °С для натуральных грибков составляет 16 - 18ч, для сухих - 24 - 28 ч. Кислотность сгустка 90 - 1 10 °Т. В микроскопическом препарате наблюдаются диплококки, короткие цепочки, единичные палочки и клетки дрожжей (рис. 1).

Рисунок 2. Микроскопическая картина грибковой кефирной закваски

Бифидобактерии - это облигатная и доминирующая часть кишечной микрофлоры здорового человека и теплокровных животных. Она проявляет антагонистическую активность по отношению к патогенным, условно-патогенным и нежелательным микроорганизмам в кишечнике.

В настоящее время идентифицировано 24 вида бифидобактерий (от лат. bifidus - раздвоенный, расщепленный надвое), объединенных в род Bifidobacterium, который относится к семейству Actinomycetaceae.

Наиболее изученными видами бифидобактерий являются: B. bifidum, B. adolescentis, B. breve, B. longum, B. infantis, B. pseudolongum, B. thermophilum и др. Типовой вид -B. bifidum.

Бифидобактерии представляют собой чрезвычайно вариабельные по форме палочки - прямые, изогнутые, разветвленные, раздвоенные Y- или V-формы, булавовидные, лопатовидные. Клетки располагаются одиночно, парами, иногда цепочками, палисадом или розетками, размер клеток 0,5-1,3 х 1,5-8 мкм. Грамположительные, не образуют спор и капсул, неподвижные. Микроскопическая картина каждого вида бифидобактерий имеет особенности по размеру, форме и расположению клеток.

Рисунок 3. – Микроскопическая картина бифидобактерий.

Бифидобактерии культивируют, создавая анаэробные условия или снижая окислительно-восстановительный потенциал среды, на молоке, гидролизованном молоке и гидролизате казеина, а также на печеночном бульоне с добавлением ростовых веществ (дрожжевого автолизата, кукурузного экстракта, цистеина и др.). На плотных питательных средах бифидобактерии образуют разнообразные колонии: плоские, полушаровидные, блестящие, шероховатые, окруженные валиком, имеющие более темный центр и т.д. Цвет колоний изменяется от белого и серого до темно-коричневого. Колонии часто напоминают по форме зерно гречихи или усеченную треугольную пирамиду, на некоторых средах колонии имеют форму чечевичек. Размеры колоний от 0,5 до 5 мм.

В молоке бифидобактерии развиваются медленно, так как коровье молоко не является естественной средой их обитания. Одной из причин плохого роста бифидобактерий в молоке служит растворенный в нем кислород. У них не обнаружено казеолитической активности, т.е. они могут усваивать казеин только после частичного гидролиза. В результате расщепления казеина образуются полипептиды, гликопептиды, аминосахара, стимулирующие рост бифидобактерий. Другой причиной заторможенного роста бифидобактерий может быть и их низкая фосфатазная активность.

Рост бифидобактерий в коровьем молоке стимулируют экстракты дрожжей, гидролизованное молоко, а также увеличение соотношения белок: лактоза. Сильный стимулирующий эффект роста бифидобактрий получают при использовании гидролизатов казеина.

Растительными стимуляторами роста бифидобактерий в молоке являются обезжиренная соя, экстракт картофеля, тростниковый сахар, кукурузный экстракт, морковный сок. В качестве стимуляторов роста применяют также соли железа, сорбит, микроэлементы в виде сернокислой меди и лактата железа.

Требования, применяемые к пробиотическим микроорганизмам:

1. Они должны быть изолированы из организма тех животных и человека для которых они будут предназначены;

2. Они должны обладать полезным воздействием на организм хозяина;

3. При длительном использовании они не должны вызывать побочные эффекты, обладать колонизационным потенциалом, т.е сохраняться в пищеварительном тракте до достижения максимального положительного действия (быть устойчивыми к низким значениям pH, желчным кислотам, антимикробным субстанциям, хорошо адгезироваться к эпителию соответствующих слизистых оболочек);

4. Они должны обладать стабильными характеристиками как в клиническом, так и в технологическом плане;

5. Они должны обладать высокой степенью роста и размножения в условиях, близким таковым в кишечном тракте;

6. При введении в больших количествах они должны обладать минимальной способностью к транслокации из просвета пищеварительного тракта во внутреннюю среду макроорганизма;

7. Они должны иметь четкую физиолого - биохимическую и генетическую маркировку как для исключения фальсификации, так и для периодического контроля идентичности исходных пробиотических штаммов и производственных культур в процессе их эксплуатации.

В качестве заквасок применяются культуры различных пробиотических штаммов, таких как Bifidum, Lb.Casei и другие. Предпочтение отдается культурам прямого внесения т.к они обладают следующими качествами:

1. не требуют предварительной активации;

2. отсутствие процесса приготовления производственной закваски, связанного с высокой трудоемкостью, энергозатратами и риском потери активности заквасок;

3. обеспечение постоянного равновесия между штаммами;

4. высокая активность заквасочных культур (КОЕ до 10¹¹);

5. отсутствие пост окисления в конечном продукте, так называемый «стоп эффект»;

6. хранение заквасок при температуре +2 - +10 ⁰С, что удобно при разных видах хранения и транспортировке;

7. более широкий диапазон рабочих температур, что позволяет регулировать время сквашивания;

8. простота применения.

Закваски прямого внесения представляют собой глубокозамороженные (DVI) и сухозамороженные (DVS) культуры и представлены в гранулированной форме с высокой концентрацией культур микроорганизмов. Это растворимые в воде гранулы с диаметром от 3 до 5 мм, кремового цвета. Общее количество микроорганизмов составляет минимум 10¹⁰ бак/г. Закваска хранится при температуре -45⁰С и ниже. Содержимое упаковки зависит от вида культуры и ее активности. Активность закваски может быть в пределах от 100 до 1500 единиц активности.

Номенклатура включает следующие культуры:

• мезофильные

• термофильные

• пробиотические

• пропионово-кислые

• специальные для ускорения созревания и придания аромата сырам.

Культуры DVS применяют для производства молочной продукции с удлиненным сроком хранения (сыры, сметана, творог, йогурт и др.).

Этапы приготовления заквасок. Существуют следующие названия заквасок:

1. - промышленная закваска, оригинальная закваска - ис­ходная культура, которую молочные заводы покупают у специ­альных научно-производственных лабораторий;

2. - материнская закваска - приготавливается из оригиналь­ной на молочном заводе. Она готовится ежедневно и является, как указывает название, исходной для всех заквасок;

3. - вторичная закваска (промежуточная) – промежуточный этап производства больших объемов производственной закваски;

4- производственная закваска - используемая в производстве.

Санитарные требования к производству заква­сок. Приготовление лабораторной и производственной закваски должно производиться строго в соответствии с «Инструкцией по приготовлению и применению заквасок для кисломолочных про­дуктов на предприятиях молочной промышленности», утвер­жденной 16.11.1992 г.

В микробиологической лаборатории должно быть выделено отделение или бокс для приготовления лабораторной закваски и работы с чистыми культурами.

Термостаты и холодильники, используемые для приготов­ления и хранения заквасок, запрещается применять для других целей.

Должна быть предусмотрена очистка подаваемого наружно­го воздуха от пыли в системах механической приточной вентиля­ции. Не допускается движение воздуха, создаваемое сквозняками.

Для стерилизации воздуха в заквасочных отделениях и там­буре должны быть установлены бактерицидные лампы (БУФ-30 и др.).

Входить в заквасочное отделение разрешается только ра­ботникам, приготовляющим закваску и производящим уборку помещения.

Тара и инвентарь заквасочного отделения должны быть промаркированы.

Чистая тара и инвентарь должны быть закрыты чистым пер­гаментом или полиэтиленовой пленкой и храниться до употреб­ления на продезинфицированных стеллажах или специальных подставках. При хранении более 24 ч перед употреблением чистая тара и инвентарь вновь дезинфицируются.

Стерилизация молока для приготовления пересадочной ла­бораторной закваски объемом до 20 дм³ на стерилизованном мо­локе должна производиться в заквасочном отделении или в мик­робиологической лаборатории.

При приготовлении закваски на пастеризованном молоке весь процесс ее приготовления (пастеризация, охлаждение молока до температуры заквашивания, заквашивание, сквашивание и ох­лаждение закваски) должен производиться в одной емкости.

Не допускается использование любой закваски (сухой, ла­бораторной или производственной) с истекшим сроком годности, а также производственной закваски с повышенной кислотностью.

При использовании небольших количеств закваски, а также пересадочной закваски на стерилизованном молоке допускается перенос ее в закрытых емкостях. В этом случае перед переливом закваски края емкости с закваской должны быть протерты спир­том и профламбированы. Работник, вносящий закваску, должен надеть чистый халат и тщательно вымыть и продезинфицировать руки.