Геном митохондрий эукариотических организмов

Митохондрии – цитоплазматические органеллы. Их количество и форма варьируют в зависимости от функций клеток. У млекопитающих в клетках печени имеется от 1000 до 1500 митохондрий. Все митохондрии имеют матрикс, внутреннюю и внешнюю мембрану, именно в них происходит аэробное окисление, энергия храниться в виде аденозинтрифосфата (АТФ).

Подобно всему живому, митохондрии размножаются путем деления. Они содержат рибосомы, которые по размеру меньше (70S), чем рибосомы цитоплазмы (80S). Митохондрии имеют свою собственную ДНК и собственные гены для т-РНК. Но с другой стороны, многие (но не все) митохондриальные ферменты кодируются ядерными генами. Максимальная структурная компактность при максимальной информационной нагруженности характерна для митохондрий дрожжей, быка, человека. Сокращен набор т-РНК.

Эти и другие факты привели к гипотезе, что митохондрии происходят от микроорганизмов, которые на ранних этапах эволюции вступили в симбиотические взаимоотношения с эукариотической клеткой и до сих пор сохраняют свои специфические особенности.

Вопрос о симбиотическом происхождении митохондрий и хлоропластов остается открытым. В конце 60-х годов, культуру, содержащую амебу обыкновенную случайно заразили бактериями. Бактерии проникли в цитоплазму амеб и размножились там до численности примерно 150 тыс. штук на 1 клетку. Большинство амеб погибло, но осталась небольшая часть, которая не только выжила, но и сохранила способность делиться, не смотря на присутствие бактерий в цитоплазме. Число бактерий в их цитоплазме составило примерно 50 тысяч штук. Что самое интересное, спустя некоторое время, ядро амебы стало зависимым от присутствующих в цитоплазме бактерий, которые стали уже постоянными эндосимбионтами. Позже, в опытах, когда ядро зараженной амебы пересаживали в нормальную, но безъядерную, оно уже не могло функционировать нормально, без присутствия некогда патогенных бактерий. Эти наблюдения доказывают, что генетические функции хозяина со временем ставятся в зависимость от находящихся эндосимбионтов.

В 1981 г. сотрудниками молекулярной биологии Медицинского исследовательского центра в Кембридже выяснена организация генома митохондрий человека. Кольцевая молекула ДНК содержит 16569 нуклеотидных пар. В противоположность ядерному геному в митохондриальной нуклеотидной последовательности практически нет (или очень мало) не кодирующих участков (экзоны/интроны).

Генетический код митохондриальной ДНК по ряду характеристик отличается от универсального цитоплазматического и очень близок к белковому синтезу прокариот. Так, например, в митохондриях триплет УГА – кодирует триптофан, а не терминацию (он же – триптофан кодируется УГГ в митохондриях); в митохондриях АУА кодирует метионин, а не изолейцин; триплеты АГА, АГГ – являются стоп-кодонами, не кодируя при этом аргинин. В третьей позиции кодонов митохондриальной ДНК, которая является основным источником выраженности кода, А и Ц встречаются чаще, чем Г или Т в ядерных ДНК. Заключение: кодовый словарь ДНК ядра и ДНК митохондрий по целому ряду аминокислот не совпадают.

Митохондриальный геном человека представляет собой двухцепочечное кольцо. Цепи различаются по плотности: в градиенте СsCl. Тяжелая – (Н), легкая – (L). На схеме стрелки показывают направление транскрипции, начало стрелок совпадает с сайтом промотора. Гены митохондриальной ДНК носят особое название – плазмогены.

В состав генома входят 12S и 16S–р-РНК, гены субъединиц I, II, III оксидазы цитохрома С, цитохрома в субъединицы 6АТРазы и 9-ти других пока неизвестных белков.

Изменения генетического кода митохондрий сократили число т-РНК (22 различных тРНК), тогда как при универсальном коде необходимо 32 вида т-РНК. Фогель, Мотульски, (1989) считают : до настоящего времени генетическая рекомбинация митохондриальной ДНК человека не обнаружена, если она и происходит, то вероятно очень редко.

Примечательно, что в ооцитах содержится очень большое количество митохондрий, тогда как в спермиях их только 4. При оплодотворении эти митохондрии не попадают в ооцит. Следовательно, все митохондрии во всех клетках потомка имеют материнское происхождение. Возник вопрос: может ли мутация в отдельно взятой митохондриальной ДНК стать причиной наследственного заболевания? Если да, то такая патология будет передаваться только от ♀ всем ее детям.

Одни исследователи считают, что такой тип наследования маловероятен, ведь каждый ооцит содержит множество митохондрий. Мутация происходит в единичной митохондрии, все другие остаются с нормальной последовательностью нуклеотидов, следовательно, фенотипического эффекта быть не должно. Но если все митохондрии, полученные от ♀, будут являться потомками одной стволовой митохондрии – эффект возможен.

1. Выявлен синдром наследственной митохондриальной цитопатии. В этом случае структурные аномалии митохондрий сочетаются с недостаточностью многих митохондриальных ферментов (как следствие структурного дефекта). Клинические симптомы варьируют: прогрессирующая мышечная слабость, птоз (опущение века), офтальмоплегия (нарушена работа мышц глаза), аномалии ЦНС и периферической, клубочковая дисфункция почек. Наблюдается материнская передача, но с разной экспрессивностью, имеет место неполная пенетрантность. Нормальные и поврежденные митохондрии распределяются по дочерним клеткам случайно.

2. Болезнь Лебера – связана с атрофией зрительного нерва. Гораздо чаще встречается у мужчин. Синдром почти всегда передается по женской линии. В качестве причины заболевания упоминается дефект митохондриального фермента – тиосульфат – сульфотрансферазы. Неполная пенетрантность и экспрессивность.

3. Врожденная катаракта в сочетании с редким вариантом «цветовой слепоты» (не различие красного-синего). Патология прослежена в родословной Кюнье (1838 г.) – больная ♀ стала родоначальницей внеядерной наследственной патологии у 11 больных в 4-х поколениях.

4. Есть мнение, что некоторые патологии, приводящие к мужскому бесплодию, связаны, именно с мутациями плазмогенов.

5. Некоторые типы близнецовости могут быть обусловлены этими же причинами. При этом плазмогены наследуются, как правило, только по ♀линии.

Говоря о митохондриальной ДНК растений необходимо подчеркнуть, что в ней закодировано множество функций, необходимых для нормально дыхательной активности. Хорошо изучена итохондриальная ДНК Euglena (эвглена зеленая). Первые признаки, контролируемые митохондриями были открыты у дрожжей-сахаромицетов (была показана способность или неспособность клеток к дыханию на субстрате с глюкозой). Было доказано, что митохондриальная ДНК может нести мутантные гены, определяющие устойчивость к целому ряду антибиотиков: эритромицину, олигомицину и др.

Плазмиды

В самых первых лекциях говорилось о том, что генетики научились внедрять в бактерии гены, контролирующие образование функционально активных белков человека. Вся процедура именуется клонированием генов или амплифицированием. Белки, которые раньше получали в ничтожно малом количестве, теперь нарабатывают в достаточно большом. В основе этой технологии лежит необычный принцип:

Бактерии (E.coli), помимо своей собственной кольцевой хромосомы, часто содержат дополнительные маленькие кольцевые молекулы двухцепочечной ДНК, называемые плазмидами. Мутации, связанные с плазмидами позволяют бактериям перейти на новый вид питания. Плазмиды реплицируются автономно, и сами могут содержать гены, определяющие устойчивость бактерий к антибиотикам или/и гены, контролирующие синтез веществ, убивающих другие бактерии (например, колицины).

Плазмидную ДНК можно выделить, затем подходящей рестриктазой расщепить в 1-ом сайте, превратив тем самым кольцевую молекулу в линейную с липкими концами. Фрагменты любой чужеродной ДНК с липкими концами, уже при помощи лигаз можно «сшить» с плазмидной ДНК в общее кольцо. Рекомбинантную конструкцию вводят в бактерию, где она реплицируется. Откуда взят фрагмент экзогенной ДНК – значения не имеет. Можно вшивать даже искусственно синтезированные гены. Если мы внедрили плазмиду с фактором устойчивости к антибиотику, то E.coli будет давать колонию на субстрате с антибиотиком. Нетрансформированные E.coli при этом расти не будут.

Организм человека является средой обитания для сотен видов бактерий и вирусов. С биологической точки зрения организм человека представляет собой целую систему сосуществующих организмов-симбионтов. Далеко не все из симбионтов патогенные. Без некоторых видов бактерий человек просто не способен существовать, их утрата или снижение количества является причиной развития ряда тяжелых заболеваний. Расшифровка геномов многих болезнетворных микроорганизмов с идентификацией всех белков поможет разработать методы предупреждения и лечения инфекционных болезней.

Оказалось, что геномы многих паразитирующих микроорганизмов обладают огромной пластичностью, имеются значительные структурные различия между штаммами бактерий, обитающих в разных частях одного организма. Для развития инфекционного процесса большое значение имеет генетический статус самого хозяина. Например, отдельные индивидуумы являются носителями вируса иммунодефицита, но СПИДом не болеют. У этих лиц имеется мутация в гене, кодирующем поверхностный белок, ответственный за попадание вируса внутрь лимфоидных клеток. Плотность белка на поверхности клеток снижена, вирус удерживается, но внутрь не попадает. Частота гомозигот по этой мутации среди жителей Европы составляет около 1%, они имеют выраженную устойчивость к ВИЧ-инфекциям. Более устойчивыми оказываются и гетерозиготные носители мутации, в российской популяции их частота достигает 13%.

Общий вывод: митохондрии животных и растений, пластиды растительных клеток, плазмиды бактерий содержат собственную автономную ДНК, которая способна реплицироваться, транскрибировать рРНК, тРНК с последующим их участием в белковом синтезе. Органоиды цитоплазмы (хлоропласты, митохондрии), обладающие собственной автономной ДНК, образуют совокупность наследственных задатков, именуемую плазмоном. Кроме ядерной наследственности существует и цитоплазматическая.

Тема: 14. КАРИОТИП. ОБЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА

Общая организация хромосом человека традиционна: в метафазе хромосома состоит из двух сестринских хроматид, соединенных центромерой, которая делит хроматиду на два плеча. Плечи могут бьггь равными, тогда хромосома называется метацентрической. Если одно плечо немного короче другого, то хромосома именуется субметацентрической. В нескольких парах хромосом че­ловека одно плечо сильно короче другого, такие хромосомы носят название акроцентрических. Тонкая морфология хромосом зависит от фазы митоза. Наиболее сильно спирализованы хромосомы в мета- и анафазе.

При стандартных методах окрашивания хромосомы человека систематизируют на классы, учитывая размеры, относительную длину плечей, положение центромеры и центромерный индекс, ко­торый отражает отношение (%) длины короткого плеча к длине всей хромосомы. Каждая пара гомологичных хромосом имеет свой но­мер, а все 23 пары хромосом человека разбивают на 7 групп (рис. 3). В группу А (1—3) входят пары наиболее крупных метацентричес-ких аутосом. Группа В (4—5) объединяет две пары субметацентри-ческих хромосом, не различимых между собой. Группа С (6—12) содержит семь пар аутосом среднего размера. Размеры и форма этих хромосом неодинаковы, однако стандартные методы окрашивания не позволяют их идентифицировать. В группу D (13—15) объеди­нены три пары акроцентрических хромосом среднего размера, мор­фологически сходных между собой. Все хромосомы группы D со­держат спутник, который не всегда выявляется, может быть очень большим, а иногда и двойным. Длина короткого плеча этих хромо­сом также изменчива. К группе Е (16—18) относятся три пары по­чти метацентричёских хромосом, из которых в 16-й паре центроме-ра наиболее близка к середине, а две другие пары не отличимы друг от друга. Группа F содержит мелкие метацентрические аутосомы (19—20), группа G — мелкие акроцентрические (21—22). Внутри групп F и G пары хромосом неразличимы. Длина коротких плечей у них изменчива, как и у хромосом группы D. Короткие плечи хро­мосом групп D и G содержат районы ядрышкового организатора. Перечисленные 22 пары хромосом относятся к аутосомам, одина­ковым у мужчин и женщин.

Половые хромосомы составляют 23-ю пару. У женщин — это две Х-хромосомы. У мужчин — Х- и Y-хромосомы. Половая Х-хромосома неотличима от аутосом группы С. При стандартном окраши­вании она включается в состав этой группы. Мужская половая Y-хромосома является акроцентрической, сходна по морфологии с хромосомами группы G, но ее легко отличить по морфологическим критериям. Длина короткого плеча У-хромосомы изменчива и ин­дивидуальна. Причем варианты длины плеча наследуются от отца к сыну. Y-Хромосома, в отличие от хромосом последней группы, не имеет спутников.

Анализ препаратов хромосом человека показал, что в ряде слу­чаев, как уже говорилось выше, на некоторых хромосомах могут существовать вторичные перетяжки. Спутничными перетяжками обладают все акроцентрические хромосомы (пары 13,14,15,21,22). Вторичная перетяжка бывает также в аутосомах пары 9. В них она располагается в околоцентромерном районе длинного плеча.

Современные цитогенетические методики позволяют иденти­фицировать по морфологии все пары хромосом на препарате, а в ряде случаев и хромосомы внутри одной пары. Суть этих методик состоит в дифференциальном окрашивании нативных хромосом по длине, что обеспечивается сравнительно простыми температурно-солевыми воздействиями на фиксированные хромосомы или ис­пользованием специфических красителей. Дифференциальное ок­рашивание приводит к появлению линейного рисунка в виде по­лос по длине хромосомы.

Индивидуальная совокупность полос, различающихся по шири­не и интенсивности окрашивания, образует цитологическую карту каждой хромосомы. При описании кариотипа на каждой метафазной хромосоме буквами латинского алфавита р и q обозначают со­ответственно короткое и длинное плечо, а затем номера сегментов. Принятые обозначения используют также для описания хромосом­ных перестроек. Например, кариотип мужчины с увеличением сег­мента 21-й хромосомы в коротком плече 5-й хромосомы следует за­писать: 46, XY,+5р21.

Основанные на дифференциальном окрашивании хромосом ци­тологические карты имеют исключительное значение для развития цитогенетики человека. С помощью этих карт стало реальным вы­яснение происхождения аномальных хромосом, вплоть до точного описания, какие конкретно районы вовлекаются в ту или иную фор­му хромосомного нарушения. На международных совещаниях по но­менклатуре в цитогенетике человека была разработана и введена в практику система обозначения сегментов нормальных хромосом и хромосом, подвергшихся тем или иным структурным перестройкам.

Половой хроматин. В соматических клетках женщин половой хроматин выявляется в виде гетерохроматина — небольшой, хоро­шо окрашиваемой структуры округлой формы размером 0,8— 1,1 мкм, находящейся возле ядерной мембраны (рис. 7), которую называют также тельцем Барра. Половой гетерохроматин — это одна из Х-хромосом, находящаяся в неактивном (суперспирализованном) состоянии.

Известно, что фенотипически пол у человека определяется на­личием или отсутствием Y-хромосомы, а не количеством Х-хромо­сом. Если в кариотипе зиготы присутствует хотя бы одна Y-хромосома, то по фенотипу формируется мужчина. Количество телец Бар­ра в клетках всегда на одно меньше, чем число Х-хромосом. То есть только одна Х-хромосома в соматических клетках человека (и мужчины, и женщины) всегда находится в активном состоянии. В норме женщина имеет две, а мужчина одну Х-хромосому. В связи с этим инактивация второй Х-хромосомы у женщин в виде полово­го гетерохроматина служит механизмом компенсации различий в дозе генов, не оказывающих влияния на развитие половых призна­ков и признаков, сцепленных с Х-хромосомой.

Этот же механизм оказался фактором, благоприятствующим носителям Х-хромосомных анеуплоидий. Какое бы количество Х-хромосом они не несли, генетически активна только одна. Остальные же Х-хромосомы су­ществуют в виде факультативного полового гетерохроматина. По­этому по количеству телец Барра в соматических клетках можно диагностировать патологическую форму дисбаланса по половым хромосомам. Например, у женщин с кариотипом 47, XXX обнару­живаются два тельца Барра, а с кариотипом 45, ХО не обнаружива­ется ни одного. У мужчин с кариотипом XXY — одно.