Определение физико-химических и структурных свойств мембран эритроцитов

Физико-химические характеристики мембран эритроцитов определяли флюорометрическим способом с применением зондов. Методы основаны на изменении интенсивности флюоресценции зондов в зависимости от свойств мембран

Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флюоресцентные зонды в исследовании биологических мембран.-М.: Наука.-1980.-320 с.

Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов.-М., Наука.-1989.-276 с

Работа с пиреном

С применением гидрофобного зонда пирена изучали 4 параметра мембран эритроцитов: погруженность белков в липидный бислой (F), микро­вязкость зон белок-липидных контактов (F₂₈₆), микровязкость липидного бислоя (F₃₃₄) и полярность микроокружения липидов (F_372/393). Определение погруженности белков в липидный бислой основано на уменьшении флюо­ресценции, обусловленном безызлучательным переносом энергии с пирена на ароматические аминокислоты в составе мембранных белков. Определение микровязкости (F₂₈₆ и F₃₃₄) основано на изменении степени эксимеризации молекул пирена в зависимости от свойств липидного бислоя. Эксимерная и мономерная формы пирена имеют собственные _эмисс.

РЕАКТИВЫ

Биосубстрат (суспензия клеток) выверен по белку: 0,1 мг/мл (100 γ/мл)

1мМ пирен = 4 мг пирена в 20 мл этанола

вносимый в пробу объем пирена определить титрованием экспериментально: необходима точка (концентрация пирена) перед выходом кривой флюоресценции на плато.

ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ.

1 мл суспензии эритроцитов инкубировали 15 секунд на магнитной мешалке,

флюориметр _{возбуждения}=286 нм и _{эмиссии}=330 нм (нативная флюоресценция мембран, F⁰).

Вернуть в бюкс всю пробу

+ 5 мкл пирена.

Инкубировать пробу на мешалке 45 секунд и измеряли флюоресцен­цию при различных длинах волн:

_возб = 286 нм, _эмисс = 330 нм - F^/

_возб = 286 нм, _эмисс = 470 нм - F_{э 286}

_возб = 286 нм, _эмисс = 395 нм - F_{м 286}

_возб = 334 нм, _эмисс = 470 нм - F_{э 334}

_возб = 334 нм, _эмисс = 395 нм - F_{м 334}

_возб = 334 нм, _эмисс = 372 нм - F₃₇₂

_возб = 334 нм, _эмисс = 393 нм - F ₃₉₃

Погруженность белков в липидный бислой  F = F⁰ - F^/

Микровязкость зон белок-липидных контактов F₂₈₆ = F_{э 286} / F_{м 286}

Микровязкость липидного бислоя F₃₃₄ = F_{э 334} / F_{м 334}

Полярность микроокружения липидов F_372/393= F₃₇₂ / F₃₉₃

Работа с анс

Используя зонд 1-анилинонафталин-8-сульфат (1,8-АНС) (АНС), иссле­довали поверхностный заряд мембран эритроцитов. Метод основан на из­мерении флюоресценции проб в присутствии АНС. Усиление флюоресцен­ции после введения АНС обусловлено излучением связанной с положительно заряженными группами на по­верхности мембраны формы зонда; вклад свободного АНС во флюорес­ценцию проб пренебрежимо мал. Отрицательный заряд мембран и интенсивность флюоресценции связаны обратнопропорциональной зависимостью.

РЕАКТИВЫ

Биосубстрат (суспензия клеток) выверен по белку: 0,1 мг/мл (100 γ/мл)

1 мМ АНС : 3,1 мг АНС в 10 мл дис-воды

ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ.

1 мл суспензии эритроцитов инкубировали 15 секунд на магнитной мешалке

флюориметр _возб = 360 нм и _эмисс = 480 нм (нативная флюоресценция мембран, точка 0 мкл АНС).

Вернуть в бюкс всю пробу

+ 20 мкл АНС.

Инкубировать пробу на мешалке 1 мин и измерить F при тех же длинах волн (точка 20 мкл АНС).

Контрольные и опытные про­бы сравнивали между собой отдельно по обеим точкам.