ОБЩАЯ ФОРМУЛА ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ВЕЩЕСТВА

При расчете по коэффициенту молярной экстинкции:

С [Моль]= , где

Dоп и D хп – оптическая плотность опытной и холостой пробы,

ε0 – коэффициент молярной экстинкции, ^-1×см^-1,

l – длина оптического пути (толщина кюветы), см

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Единица активности – международная единица МЕ (UI) = 1 мкМоль / мин

Чаще всего используют удельную активность – активность, отнесенную к белку = МЕ / мг белка,

т.е, активность фермента МЕ / мг = мкМоль / (мин × мг белка)

Активность (МЕ/мг) = , где

Dоп и D хп – оптическая плотность опытной и холостой пробы,

Vпробы – объем пробы, л;

ε0 – коэффициент молярной экстинкции, ^-1×см^-1,

l – длина оптического пути (толщина кюветы), см,

t – время инкубации, мин;

Vs – объем биосубстрата, мл;

С – концентрация белка в биосубстрате, мг/мг.

Приготовление хлороформного экстракта

Bligh E.G., Dyer W.J. // Can. J. Biochem. Physiol – 1959 – 37 P.911

ПРИНЦИП МЕТОДА. Ме­тод основан на том, что гидрофобные липиды экстрагируются в гидрофоб­ную среду хлороформа, а все водорастворимые молекулы переходят в водно-метанольную фазу.

РЕАКТИВЫ

Метанол

Хлороформ

ХОД РАБОТЫ. В стеклянный стаканчик наливали 1,35 мл дистиллированной воды, добавляли 0,25 мл субстрата, 4 мл метанола и 2 мл хлоро­форма. На магнитной мешалке экстрагировали липиды в течение 3 мин. Затем добавляли 2 мл хлороформа и 2 мл дистиллированной воды. После разделения слоев (5 час, холодильник) при помощи шприца с длинной иглой отбирали нижний хлороформный слой, в котором определяли общие липиды, диеновые конъюгаты.

Экспресс-вариация. После добавления хлороформа и дис-воды пробу перелить в центрифужную пробирку и поместить в морозилку на 30 мин или больше. Потом отцентрифугировать (5-10 мин 3000 об.) – происходит разделение фаз. Отобрать нижнюю хлороформную фазу.

Определение Шиффовых оснований шо

Bidlack, Tappel

ПРИНЦИП МЕТОДА. IШО имеют хромоформные системы с максимумом возбуждения при λ=360 нм максимумом флюоресценции при λ=440 нм

РЕАКТИВЫ

Хинин-сульфат (стандарт) 1 мг/мл (10 мг в 10 мл дис-воды)

ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ.

1 мл хлороформного экстракта. Измерить флюоресценцию на спектрофлюориметре λ возб = 360 нм; λ эмис = 440 нм

Холостая проба: хлороформ

Стандартная проба: хинин-сульфат при тех же λ

Содержание ШО выражают в условных единицах (относительные единицы флюоресценции о.е.ф.) приведенных к общим липидам

ШО [о.е.ф. / мг ОЛ] = , где

Fоп и Fстанд – флюоресценция опытной и стандартной пробы,

С – концентрация липида в хлороформном экстракте, мг/мл.

Можно не пересчитывать на хинин-сульфат, а выдавать результат в единицах флуоресценции, приведенных к липиду : ШО [е.ф. / мг липида] = Fоп / С

Определение диеновых конъюгатов дк

Стальная И.Д. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных жирных кислот // Современные методы в биохимии.- М.: Медицина, 1977.- С. 63-64

ПРИНЦИП МЕТОДА. Метод основан на образовании системы сопряженных диеновых связей, для которых характерен максимум поглощения в гексане при 233 нм.

РЕАКТИВЫ

Смесь метанол – гексан (5:1 v:v)

ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ.

2 мл хлороформного экстракта высушивали на роторном испарителе. Сухой остаток растворяли в 3 мл смеси метанол-гексан и измеряли оптическую плотность на СФ при  = 233 нм против метанол-гексановой смеси.

Холостая проба: метанол-гексановая смесь

Содержание ДК вычисляли исходя из ₀=2.1×10⁵ М^-1 см^-1 и выражали в [мкМ/мг ОЛ].

Определение малонового диальдегида мда

Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитутовой кислоты // Современные методы в биохимии.- М.: Медицина, 1977.- С. 66-68

ПРИНЦИП МЕТОДА. Метод основан на образовании в кислой среде триметинового комплекса, состоящего из одной молекулы МДА и двух молекул 2-тиобарбитуровой кислоты (ТБК), который обладает розовым цветом.

РЕАКТИВЫ

30% трихлоруксусная кислота ТХУ: 300 г ТХУ довести до 1 л дис-водой

0,75% 2-тиобарбитуровая кислота ТБК: 7,5 г ТБК в 1 л 0,05 н NaOH

0,05 н NaOH: 2 г в 1 л дис-воды

ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ.

1 мл биосубстрата S (0,2 мл плазмы)

+ 1 мл 30% ТХУ

+ 1 мл 0,75% ТБК.

Кипящая водяная баня (+100⁰С) 20 минут (закрыть пробирку капелькой-колпачком)

охладить и центрифугировать 10 минут при 3000 об/мин.

В надосадочной жидкости определяли оптическую плотность на ФЭК =540 нм или СФ =532

Холостая проба: вместо биоS взять дис-воду, обработать так же.

Количество МДА рассчитывали исходя из ₀=1.56×10⁵ М^-1см^-1 и выражали в [нМ/мг ОБ].