16. Основные физико–химические свойства белков и методов количественного определения белков в биологических объектах.

Наиболее характерными физико-химическими свойствами белков являются высокая вязкость растворов, незначительная диффузия, способность к набу­ханию в больших пределах, оптическая активность, подвижность в электри­ческом поле, низкое осмотическое давление и высокое онкотическое давле­ние, способность к поглощению УФ-лучей при 280 нм (это свойство, обусловленное наличием в белках ароматических аминокислот, использует­ся для количественного определения белков). Белки, как и аминокислоты, амфотерны благодаря наличию свободных NH2- и СООН-групп. Для них характерны все свойства кислот и оснований. В зависимости от реакции среды и соотношения кислых и основных аминокислот белки в растворе несут или отрицательный, или положитель­ный заряд, перемещаясь к аноду или катоду. Это свойство используется при очистке белков методом электрофореза. Белки обладают явно выраженными гидрофильными свойствами. Раст­воры белков имеют очень низкое осмотическое давление, высокую вязкость и незначительную способность к диффузии. Белки способны к набуханию в очень больших пределах. С коллоидным состоянием белков связан ряд характерных свойств, в частности явление светорассеяния, лежащее в основе количественного определения белков методом нефелометрии. Молекулы белка не способны проникать через полупрони­цаемые искусственные мембраны (целлофан, пергамент, коллодий), а также биомембраны растительных и животных тканей. 1. Осаждение белка из раствора может быть достигну­то многими разнообразными приемами. Реакциями осаж­дения пользуются для обнаружения белка в растворе, для разделения белковых фракций, а также для получе­ния безбелковых фильтратов. Для осаждения белка нужно лишить его факторов, удер­живающих его в растворе, используя различные агенты, снижающие заряд или разрушающие гидратную оболоч­ку белковой частицы. Процесс денатурации белка сводится к разрушению нативной вторичной и третичной структуры белка, при этом белковая молекула, как правило, теряет свои биологические свойства. 2. Осаждение белка при нагревании. Почти все белки денатурируют при нагревании (50—55° С и выше). Механизм тепловой денатурации связан с пере­стройкой структуры белковой молекулы, в результате которой белок теряет свои нативные свойства, уменьшает­ся его растворимость (уменьшение гидрофильных свойств ведет к нарушению гидратной оболочки). Присутствие солей и концентрация водородных ионов играют важную роль в выпадении в осадок денатурированного при нагре­вании белка. Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждают в слабокислой среде, белки, обладающие щелочными свойствами,— в слабощелочной среде. 3. Осаждение белка концентрированными минеральными кислотами. 4. Осаждение белка органическими кислотами. 5. Осаждение белка алкалоидными реактивами. 6. Осаждение белка солями тяжелых металлов.

17. Биосинтез мочевины. Связь орнитинового цикла с превращениями фумаровой и аспарагиновой кислот: происхождение атомов азота мочевины. Нарушения синтеза и выведения мочевины. Гипераммониемия.

Основным механизмом обезвреживания аммиака в организме является биосинтез мочевины. Последняя выводится с мочой в качестве главного конечного продукта белкового, соответственно аминокислотного, обмена. На долю мочевины приходится до 80-85% от всего азота мочи. Основным и, возможно, единственным местом синтеза мочевины является печень. Впервые Г. Кребс вывели уравнения реакций орнитинового цикла мочевинообразования Кребса. На первом этапе синтезируется макроэргическое соединение карбамои л фосфат-метаболически активная форма аммиака, используемая в качестве исходного продукта для синтеза пиримидиновых нуклеотидов (соответственно ДНК и РНК) и аргинина (соответственно белка и мочевины).* К настоящему времени открыты три разных пути синтеза карбамоил-фосфата de novo, катализируемые тремя разными ферментами. Первую необратимую реакцию катализирует регуляторный фермент-аммиакзависимая карбамоилфосфатсинтетаза.* Реакция требует затраты двух молекул АТФ, открыта в митохондриях леток печени и используется преимущественно для синтеза аргинина мочевины. В этой реакции в качестве активного стимулирующего аллостерического эффектора действует N-ацетилглутамат. Вторую, также необратимую, реакцию катализирует глутаминзависимая карбамоилфосфатсинтетаза*. Данная реакция открыта в цитозоле клеток животных и требует наличия ионов Mg . Следует указать, что благодаря включению гидролитической стадии она используется преимущественно для синтеза пиримидиновых нуклеотидов (см. далее). Фермент широко распространен в клетках жи­вотных. Третью обратимую реакцию катализирует карбаматкиназа. На втором этапе цикла мочевинообразования происходит конденсация карбамоилфосфата и орнитина с образованием цитруллина; реакцию ка­тализирует орнитин-карбамоилтрансфераза. На следующей стадии цитруллин превращается в аргинин в результате двух последовательно протекающих реакций. Первая из них, энергозави­симая,- это конденсация цитруллина и аспарагиновой кислоты с обра­зованием аргининосукцината (эту реакцию катализирует аргининосукцинат-синтетаза). Аргининосукцинат распадается в следующей реакции на ар­гинин и фумарат при участии другого фермента- аргининосукцинатлиазы. На последнем этапе аргинин расщепляется на мочевину и орнитин под действием аргиназы. Суммарная реакция синтеза мочевины без учета всех промежуточных продуктов может быть представлена в следующем виде: СO2+NH3+3АТФ+2Н2О+АСПАРТАТ->МОЧЕВИНА + 2АДФ +АМФ+ ФУМАРАТ +2PI +PPI. Данная реакция сопровождается снижением свободной энергии = — 40 кДж), поэтому процесс всегда протекает в направлении синтеза мочевины. Аминоацидурия. Качественный и количественный состав аминокислот мочи человека имеет, прежде всего, диагностическое значение, поскольку некоторые болезни человека возникают вследствие первичного нарушения обмена отдельной аминокислоты или группы аминокислот. Встречаются наследственные дефекты всасывания аминокислот в почках. Одним из хорошо известных заболеваний считается цистиноз, который рядом авторов отождествляется с синдромом Абдергальдена - Фанкони как по клиническим и биохимическим проявлениям, так-и по характеру наследственной передачи болезни. Цистинурия - эта врожденная аномалия обмена обусловлена полным блокированием реабсорбции цистина и частичным нарушением всасывания трех других аминокислот в почках. При наследственном пороке обмена- гепатоцеребралъной ди­строфии (болезнь Вильсона), помимо генерализованной (общей) гипераминоацидурии, отмечаются снижение концентрации медьсодержащего белка церулоплазмина в сыворотке крови и отложение меди в мозге, печени, почках. Аналогичная гипераминоацидурия наблюдается при галактоземии, синдроме Лоу и других наследственных заболеваниях. Пониженная экскреция аминокислот описана при квашиоркоре. Фенилкетонурия (фенилпировиноградная олигофрения) развивается, как результат потери способности организма синтезировать фенилаланин-4- онооксигеназу, катализирующую превращение фенилаланина в тирозин. Характерные особенности болезни-резкое замедление умственного развития ребенка, а также экскреция с мочой больших количеств фенилпировиноградной кислоты (до 1 - 2 г/сут) и фенилацетилглутамина.