Контрольні питання

1.    Практичне застосування амінокислот.

2.     Які мікроорганізми використовуються для промислового отримання білка?

3.     Сировина, що використовується для отримання мікробного білка.

4.     Мікроорганізми, що застосовуються для отримання вітамінів.

5.     Які відомі ростові речовини мікробного походження?

6.     Що таке антибіотики? Їх значення в рослинництві та тваринництві.

7.    Як утворюються стійкі до антибіотиків форми мікробів?

8.     Мікроби - продуценти антибіотиків.

9.     Способи застосування антибіотиків у рослинництві.

10. Які ферменти мікробного походження використовують в промисловості?

11. Продуценти протеолітичних ферментів.

 

 

Глава 8. Мікробіологія борошна, круп, комбікормів

3.1. Сапрофітна мікрофлора зерна

Зерно багате поживними речовинами, які за певних умов стають сприятливим середовищем для розвитку мікрофлори яка погіршує його якість при зберіганні. Основним джерелом потрапляння мікрофлори на поверхню рослин, а потім і на зерно є ґрунт. Ґрунти, особливо родючості, багаті органічними і мінеральними речовинами. При достатньому вмісті вологи і доступі повітря вони стають оптимальним середовищем дня розвитку бактерій, актиноміцетів, грибів. Нерідко в 1 г ґрунту нараховуються десятки і сотні мільйонів мікроорганізмів.

Особливо багатий мікрофлорою шар ґрунту, який прилягає до коренів рослин (ризосфера), де в переважній кількості виявляються неспороутворюючі паличкоподібні бактерії родів Erwinia та Pseudomonas, а також маслянокислі і гнильні бацили, в числі яких найбільш часто зустрічаються Bacillus mycoides, Bacillus megatherium та ін. Крім бактерій, в ризосфері постійно знаходяться сапрофітні міцеліальні гриби, деякі види дріжджів і дуже часто актиноміцети. Крім сапрофітів нерідко присутні різні фітопаразити – збудники хвороб рослин. У процесі вегетації частина мікроорганізмів, що мешкають в зоні кореня, переходить на надземні органи рослин. Спочатку вони поселяються на стеблах, листках, а потім переходять на зав'язь і дозріваюче зерно в колосі, початку, волоті і т.д. Мікроорганізми також заносяться на поверхню рослин вітром, опадами, комахами, птахами. Внаслідок нестачі поживних речовин і вологи на поверхні рослин можуть розвиватися тільки епіфітні мікроорганізми (епіфіти). Епіфіти не проникають в тканини рослин і не надають шкідливого впливу на їх розвиток. Відомо, що серед епіфітів зустрічаються стимулятори росту рослин та антагоністи фітопатогенних грибів. Чисельний і видовий склад епіфітної мікрофлори рослин в значній мірі залежить від температури і вологості середовища.

При теплій вологій погоді на поверхні рослин переважають безспорові паличкоподібні бактерії, в суху, жарку замість них з»являються спороутворюючі Bacillus subtilis, Вас. mycoides та ін У умовах вологої прохолодної погоди часто розвиваються міцеліальні гриби родів Fusarium, Rhiropus та ін. На поверхні рослин, які виділяють більшу кількість вологи і продуктів обміну, розвивається більш різноманітна мікрофлора. Типовими епіфітом, які постійно присутні на поверхні зелених рослин, звідки потрапляють на зерно, є бактерії родів Erwinia та Pseudomonas. Erwinia herbicoia (трав'яна паличка) являє собою дрібну (1-3 x 0, 7 мкм) рухому паличку, що має 1-2 полярних джгутика (грамнегативна, безспорова, факультативний анаероб). На мясопептонном агарі утворює гладенькі колонії, які мають спочатку сіруватий відтінок, що змінюється поступово до золотисто-жовтого. На твердих цукровмісних середовищах спостерігається рясне слиноутворення

.Вміст Erwinia herbicola на зерні, взятому безпосередньо з колосся або відразу після обмолоту, досягає 90 % і більше від загального числа мікроорганізмів. Переважна кількість даного виду бактерій є певною мірою показником свіжості і доброякісності зерна. Бактерії Pseud. fluorescens виявлені на зерні, що має підвищену вологість у момент збирання, а також на морозобійному .Мікрококи, бацили, дріжджові гриби виявляються в значних кількостях лише на вологому зерні, яке не було своєчасно підсушене після обмолоту, зберігалося в купі протягом 3-4 діб при температурі вище 10 °С, мало ознаки самозігрівання. Заселеність зерна різноманітної мікрофлорою, часто випадковою, може різко зростати в процесі збирання, особливо при прямому комбайнуванні. Основні джерела мікрофлори: пил, пісок, засмічені домішки, що потрапляють у зернову масу при скошуванні і обмолоті. Роздільне прибирання, проведене в умовах сухої погоди, сприяє підсиханню зерна у валках і зниженню загальної кількості мікроорганізмів .Вологість зерна проса і гречки, отриманого прямим комбайнуванням, досягає в середньому 22 %, при роздільному прибиранні – 14 %. Число бактерій на зерні при роздільному прибиранні становить від 2,6 до 73,0 тис. на 1 г, а при прямому комбайнуванню, від 30 до 4000 тис. на 1 г. Число грибів при роздільному прибиранні коливається від 0,8 до 4,0 тис., а при комбайновому від 0,6 до 20 тис. на 1 г. Накопичування мікроорганізмів у зерновій масі нерідко відбувається під час перевезень зерна до зерносховищ. Внаслідок цього, неприпустимо використовувати забруднені транспортні засоби і тару, так як вони можуть бути джерелом потрапляння на зерно не тільки сапрофітних, але і патогенних для людини і тварин мікроорганізмів. Важливе значення у підвищенні мікробіологічної засіяності зерна мають його механічні пошкодження, отримані в процесі обмолоту і подальшої обробки. Загальна кількість мікроорганізмів на поверхні свіже прибраного зерна залежить від будови оболонок, ступеня опушенности насіння, наявності квіткових оболонок, стулок бобів і т. д.. Насіння бобових культур при однакових умовах містять на поверхні менше мікроорганізмів, ніж насіння злакових. Це пояснюється тим, що на насінні бобових, щільно закритих в стулках, мікроорганізми практично відсутні до моменту лущіння. Крім того, гладка оболонка насіння не дає можливості мікроорганізмам затримуватися на ній. Наявність у зерна злакових борідки, шорсткуватих насіннєвих оболонок і квіткових оболонок створює умови для осідання на його поверхні значного числа мікроорганізмів.

По мірі дозрівання в зерні зменшується вміст цукрів, збільшується вміст крохмалю і геміцелюлози, знижується активність ферментативних процесів, відбувається різка втрата води (до 25 % і нижче). Внаслідок зазначених змін зерно стає недостатньо сприятливим субстратом для мікроорганізмів і багато їх видів переходять в стан спокою (анабіозу). Встановлено, що стигле сухе зерно, взяте безпосередньо з поля з колосся, качана, волоті містить обмежену за видовим складом зернову мікрофлору, Така мікрофлора представлена головним чином епіфітними бактеріями (Erwinia herbicoІa) і специфічною групою грибів, які отримали назву польові цвілі, або польові гриби.

Зерно злакових, бобових, олійних культур, узяте з поля або з бункера комбайна, часто містить польові гриби. Найбільш розповсюджені представники вказаної групи - недосконалі гриби родів Alternaria, Helminthosporium, Fusarium, Dematium та ін. При детальному аналізі грибний флори виявлена певна видова специфічність польових грибів для зерна тієї чи іншої культури. На зерні пшениці, ячменю, рису постійно виявляються види Alternaria, Helminthosporium, для кукурудзи характерні Fusarium, Cephalosporium, на зерні вівса, крім названих, нерідко присутні гриби роду Trichoderma, а на зерні гречки часто зустрічаються Ascochyta ін.

Встановлено, що гриби Alternaria - універсальні мешканці зернівок пшениці і присутні звичайно у вигляді міцелію під зовнішніми шарами перікарпію (околоцвітини). Зерно при цьому зберігає повноцінний зовнішній вигляд і має схожість не нижче 95-96 %. На відміну від Alternaria гриби родів Helminthosporium і Fusarium часто знижують схожість і є збудниками кореневих гнилей, які викликають зниження врожайності зернових культур у середньому від 3,5 до 7 %, а в окремі роки до 15 % .Міцелій зазначених грибів найбільш часто в фазі молочної стиглості проникає в зародок і заходить в ендосперм. В результаті утворюються дефектні зернівки: щуплі, плямисті, з чорним зародком. Аналізи мікрофлори зерна різних культур показали, що гриби, які відносяться до групи польових, посівом змиву виявляються в незначних кількостях. Такі гриби виявлені, головним чином, як прихована або внутрішня мікрофлора, прямим посівом досліджуваного зерна на щільний агар Чапека. Враховуючи, що агар Чапека має оптимальний фізіологічний склад для росту насіння, одночасно з зараженістю зерна визначають його схожість. Для прямого посіву стерильним пінцетом безпосередньо з колосся або обмолоченого зразка відбирають по 100 насінин нормальних за зовнішнім виглядом, дезінфікують їх від зовнішньої мікрофлори (або без дезінфекції) і рівномірно розкладають по поверхні поживного середовища на відстані 1 – 1,5 см один від одного і від бортів чашок Петрі. На кожній чашці міститься від 10 до 25 насіння (залежно від розмірів). При попаданні на живильне середовище зерно набухає, оболонка його розм'якшується, і міцелій грибів, що знаходиться в стані спокою всередині насіння, виходить на поверхню. Після пророщування посівів в термостаті при температурі 28-30°С на протязі 3-.4 діб на світлому агарі Чапека навколо кожного зерна утворяться характерні, чітко окреслені колонії грибів і на їх фоні більш-менш розвинені проростки насіння . Щільні, темно-оливкові, темно-сірі або чорні колонії Alternaria, Helminthosporium, Cladosporium, темні слизисті-Dematium, пухнасті біло-рожеві або малинові Fusarium. Ріст інших мікроорганізмів при цьому не спостерігається .

Конідієносці і конідії темнозабарвлених грибів добре виявляються при мікроскопії 4-5 добових колоній безпосередньо в чашках Петрі із збільшенням 8x15. Органи спороношення грибів роду Fusarium виявляються у краплі суміші гліцерину з водою на предметному склі зі збільшенням 40x15. При мікроскопії в полі зору чітко помітні масові скупчення серповидних або овально-видовжених конідій, характерних для грибів цього роду.

Джерелами польових грибів, проникаючих в зерно, можуть слугувати рослинні залишки, що знаходяться в ґрунті, а також насіння рослин. Розвитку польових грибів в зернівках сприяють певні метеорологічні умови, що виникають в період дозрівання: висока відносна вологість і підвищена температура навколишнього повітря. Встановлено, що інфікування зерна пшениці польовими грибами відбувається при температурі 27-30 °С і відносній вологості повітря не нижче 80 % .Дослідження складу польових грибів зерна злакових культур залежно від погодних умов в процесі дозрівання і прибирання показують, що при відносній вологості повітря не вище 80 % на зерні пшениці, ячменю, жита, вівса, рису, кукурудзи переважають види Alternaria. Зерно при цьому має нормальний колір і схожість в межах 95–98 %. В умовах вологої погоди колосся пшениці, ячменю, взяті в період збирання, відрізняються рихлістю і сіруватим відтінком.

Зернівки, відібрані з колосся, а також з бункерів комбайнів, мають тьмяний сіруватий колір, нерідко чорну плямистість і чорний зародок. Таке зерно було інфіковане внутрішньою мікрофлорою на 100%, в складі якої виявлені переважно види Helminthosporium і Fusarium. Схожість і енергія проростання зерна різко знижені, або повністю відсутні. При посівах змивів поверхнева мікрофлора не виявлялася.

За потреби у волозі всі польові гриби - гідрофіти, так як вимагають для свого розвитку вологості, еквівалентній відносній вологості повітря 90 -100 %, яка для крохмалистого насіння хлібних злаків відповідає 30-33 % в розрахунку на суху речовину. Розвиток грибів Alternaria, Cladosporium можна було спостерігати тільки на стерильному зерні пшениці при його вологості вище 25 %.

У зв'язку з високою потребою у волозі польові гриби на зерні, яке зберігається не розвиваються (виняток - псування сирих качанів кукурудзи, яка виникає внаслідок розвитку фузаріозних грибів). У дослідах, проведених на насінні пшениці Саратовська 29 і Саратовська 42 зазначено, що при зберіганні в умовах лабораторії (t = 18-20 °С, φ = 50–70 %) зараженість грибами Alternaria повністю зникає протягом 1,5–2 років. Однак схожість насіння до цього часу також різко знижується. При температурі 40 °С гриби Alternaria sp. на насінні пшениці, вівса, ячменю відмирали в проміжку від 6 до 15 міс.

Дослідження, по визначенню внутрішнього інфікування польовими грибами насіння пшениці зі світової колекції ВІР ім. М. І. Вавилова, що зберігалися протягом 26 років, показали, що з п'яти досліджених зразків два зберегли зараженість грибами Alternaria і Helminthosporium на 30...50 % (на 100 насінин). Схожість відповідно 16 і 13 % (при закладці на зберігання – 99 %). Отже, строки виживаності польових грибів у внутрішніх тканинах зерна залежать від умов вологості і температури зберігання. При постійній певній вологості і температурі навколишнього повітря (в умовах ВІР) термін виживаності мікрофлори виявився дуже тривалим.

Крім польових грибів, до типової зерновий мікрофлорі відносяться гриби родів Aspergillus, Penicillium, Rhizopus і деякі інші. Подібні гриби майже не виявляють на дозріваючому і свіжо прибраному зерні, але виявляють на зерні, яке зберігається, що за певних умов стає основною причиною його самозігрівання і псування. Зазначена група грибів отримала назву плісеней зберігання. Умовний поділ грибний флори зерна на польові гриби і цвілі зберігання засноване на їх відмінності в потребах до змісту води в субстраті. Якщо польові гриби - гігрофіли, то багато видів грибів роду Aspergillus невимогливі до вологи (ксерофіли) і можуть розвиватися при вологості, що збігається з нижнім стандартним рівнем того чи іншого продукту (зерна). Дослідження тисяч зразків зерна хлібних злаків (ячменю, пшениці, вівса, рису, сорго, кукурудзи та інших), узятих з промислових сховищ, показали, що з початковими стадіями його псування були постійно зв'язані ксерофіли (Aspergillus restrictus і Aspergillus glaucus), здатні розвиватися при критичній і нижче критичної вологості зерна.

Відзначено, що ксерофільні види Aspergillus частіше розвиваються на сухих субстратах. Інші, більш вимогливі до вологи види цвілей зберігання (мезофіли Asp. сandidus, Asp. оchraceus, Asp. Flavus, Penicillium) розвиваються пізніше, коли внаслідок зростання ксерофілів зростає вологість зернової маси. Такі гриби, як Asp. fumigatus, Asp. niger, зазвичай не беруть участь у псуванні зерна в сховищах до тих пір, поки його вологість не прийде в рівновагу з відносною вологістю вище 90 %. Крім малої вимогливості до вологи, цвілі зберігання відрізняються виключно високою ферментативною активністю і великою поширеністю в навколишньому середовищі. Розповсюдженість цих грибів пояснюється їх здатністю утворювати величезну кількість летючих спор (конідій), за допомогою яких вони розмножуються. Підраховано, що один складний конідієносець Penicillium утворює десятки тисяч спор, гриби Aspergillus дають масу спор, кількість яких не піддається підрахунку, в той час як один конідієносець грибів роду Cladosporium дає всього від 100 до 300 конідій.

Спори грибів родів Aspergillus і Penicillium розносяться повітряними потоками, проникають в повітря приміщень, пов'язаних із зберіганням і обробкою зерна і зернових продуктів. При дослідженні зараженості спорами грибів повітря на комбікормовому підприємстві виявлено що в 1 м³ містилося від 35 до 90 тис. спор. Найбільш зараженим спорами грибів виявилося повітря дозаторного і сепараторного відділень, де проводять очищення зерна. У числі грибів переважали види Asp. glaucus, Asp. nidulans, Asp. flavus, Penicillium sp. Види Alternaria, Fusarium, Cladosporium виявилися в одиничних кількостях.

Цвілі зберігання здатні розвиватися в широкому діапазоні температур. Існують термотолерантні види Aspergillus, не тільки при помірних, але і підвищених температурах (до 50-55 °С) в процесі самозігрівання зерна і кормових продуктів. Серед грибів роду Penicillium знайдено чимало психротолерантних видів, для розвитку яких не є перешкодою низькі температури (до -5°С). Внаслідок широкого розповсюдження, високої ферментативної активності, невимогливості до нестачі вологи, здатності до виживання в умовах підвищених і низьких температур, при нестачі кисню і надлишку вуглекислоти в навколишньому середовищі - цвілі зберігання набувають найважливіше значення в зниженні якості і псування зерна, що зберігається і продуктів його переробки.

Повна відсутність або незначний вміст цвілі зберігання на дозріваючому і свіжоприбраному зерні обумовлено згубною дією сонячної радіації на прозорі спори цих грибів. Замість них на зерні переважають темно пігментовані польові гриби, стійкість яких до випромінювань пояснюється захисними властивостями меланоїдів, що утворюються в оболонках конідій, склероціях та інших структурних елементах. При короткочасному зберіганні зерна після обмолоту в купі або будь-якому сховищі, де відсутня дія сонячного світла, цвілі зберігання внаслідок біологічних особливостей, отримують перевагу в розвитку в порівнянні з польовими грибами.

Рядове зерно, взяте з різних хлібоприймальних підприємств, містить більшу або меншу кількість грибів – цвілей зберігання, головним чином видів Aspergillus, Penicillium, Rhizopus. Нерідко таке зерно має знижену схожість. Зазначені гриби виявляли не тільки в посівах змиву досліджуваного зерна, але й у складі внутрішньої мікрофлори, тобто в прямих посівах на щільний агар Чапека. Певна ступінь зараженості такого зерна цвілями зберігання пояснюється відсутністю своєчасної післязбиральної обробки (очищення, підсушування), а також можливістю вторинного зволоження в процесі перевезень і зберігання.

Виявлено також що при оптимальній температурі цвілі зберігання не тільки активно розмножуються на поверхні вологого зерна, але і проникають в його внутрішні тканини, витісняючи польові гриби. Цьому процесу може сприяти розпушування оболонок при зволоженні зерна. Присутність міцелію і спор грибів всередині зерна виявлено за допомогою скануючих електронних мікроскопів. На відміну від польових грибів, виживаємість яких за звичайних умов зберігання зерна обмежена в часі, життєздатність плісеней зберігання на зневодненому зерні і продуктів його переробки практично не має меж.