126. Реакция Кольмера

Реакция Кольмера — это реакция связывания комплемента на холоде, для постановки которой, используют кардиолипиновый, неспецифический и трепонемный антигены. Приготовление последних и обработку сыворотки производят так же, как и при постановке реакции Вассермана. В отличие от нее в реакции Кольмера вместо изотонического раствора натрия хлорида применяют свежеприготовленный солевой раствор (0,85 г химически чистого натрия хлорида и 0,1 г химически чистого магния сульфата растворяют в 1000 мл дистиллированной воды), гемолитическую сыворотку консервируют химически чистым глицерином в соотношении 1 : 1 и хранят в холодильнике, Для индикации результатов реакции используют раздельно 2 % взвесь эритроцитов барана в солевом растворе и гемолизин, разведенный по удвоенному титру.

С целью проведения реакции инактивированную сыворотку крови обследуемого разводят в соотношении 1 : 5 солевым раствором и вносят по 0>2 мл в четыре пробирки. Затем в первые три пробирки добавляют по 0,5 мл антигена, разведенного по титру, а в четвертую, контрольную,— 0,5 мл солевого раствора. Пробирки встряхивают и помещают на 20 мин в шкаф при температуре 18—20 °С. После этого в каждую пробирку приливают по 1 мл комплемента, разведенного по рабочей дозе (см. № 121), и ставят в холодильник при температуре 4—6 °С. Через 18—20 ч их помещают на 10 мин в термостат при температуре 37 °С. В вынутые из термостата пробирки добавляют по 0,5 мл гемолитической сыворотки (удвоенный титр) и 0,5 мл 2 % взвеси эритроцитов барана. Полученную смесь легкими движениями встряхивают и снова помещают на 50—60 мин в термостат при температуре 37 °С. За это время в контрольных пробирках происходит полный гемолиз.

Результаты реакции оценивают так же, как и при постановке реакции Вассермана; см. № 121).

этого на одной стороне стекла карандашом рисуют окружность диаметром 1 см, а на другую наносят равномерно распределенную взвесь бледных трепонем, занимающую всю окружность. После высушивания на воздухе препарат в течение 10 мин фиксируют химически чистым ацетоном, нумеруют и затем готовят испытуемые сыворотки.

С целью получения различных разведений сыворотки больного берут три ряда пробирок: 1-й — цельная сыворотка, 2-й — 0,45 мл изотонического раствора натрия хлорида (9 капель), 3-й ряд — 6,95 мл изотонического раствора натрия хлорида (19 капель).

Из каждой пробирки 1-го ряда берут 0,05 мл сыворотки (1 капля) и переносят, хорошо перемешивая, в пробирки 2-го ряда, получая разведение 1 : 10, из каждой пробирки 2-го ряда переносят одну каплю (0,05 мл) в 3-й ряд, что соответствует разведению 1 : 200.

На предметные стекла с высушенным антигеном наносят по 1 капле сыворотки в разведениях 1 : 10 и 1 :200, препараты помещают во влажную камеру, которую закрывают крышкой и ставят в термостат на 30 мин при температуре 37 °С (1-я фаза реакции). Затем стекла извлекают из термостата, 2 раза осторожно промывают изотоническим раствором натрия хлорида, помещают на 10 мин в изотонический раствор натрия хлорида и высушивают. На стекла наносят по 1 капле флюоресцирующей сыворотки, помещают их на 30 мин во влажную камеру, снова 2 раза промывают изотоническим раствором натрия хлорида (2-я фаза реакции).

К готовому препарату добавляют 1 каплю забуферного глицерина, накрывают покровным стеклом, на которое наносят 1 каплю иммерсионного нелюминесцентного масла (диметилфталат).

Результаты реакции учитывают по степени свечения бледных трепонем. При отсутствии в испытуемой сыворотке антител свечения не наблюдается. Яркость свечения обозначают плюсами. При интенсивно свечении на темном поле видны ярко светящиеся бледные трепонемы желто-зеленого цвета (++++). если бледные трепонемы светятся не ярко, результат обозначают +++; при слабом свечении ++; при незначительном свечении (+) реакцию считают отрицательной; ++, +++, ++++ обозначаются реакции положительные, различной степени интенсивности.

РИФ 10 применяют при серодиагностике первичного серонегатив-ного сифилиса, когда все другие реакции (Вассермана, осадочные, РИБТ) отрицательные; РИФ 200 — для серодиагностики всех других форм сифилиса, включая и латентную.

3. При спектрографии можно пользоваться только дуговым режимом,

По заключению авторов схемы и нашим собственным наблюдениям, использование описанного генератора активизированной дуги переменного тока повышает чувствительность на 1—1,5 порядка, наряду с этим, вследствие отсутствия блуждающего катодного пятна, лучше видны результаты.

Свет от вольтовой дуги через собирательную линзу переходит в щель спектрографа, ширина которой равна 0,008 мм. Проникнув в щель, луч света попадает на кварцевую призму и разлагается на спектр, который попадает на фотопластинку и дает на ней фотографическое изображение линий элементов, входящих в состав спектра. Фотопластинку помещают в кассету размером 9x24 см с разворотом 5,25 см.

Сжигание испытуемых проб перед щелью спектрографа производят на угольных электродах, специально очищенных для целей спектрального анализа. В таких электродах не содержится никаких минеральных веществ, кроме следов бора, от присутствия которого освободиться очень трудно.

Золу испытуемой пробы помещают в кратер нижнего электрода, изготовленного по методу, предложенному Г. А. Бабенко (1961). Электроды изготавливают с помощью фрезы — металлического стержня с валиком-ограничителем, который отделяет рабочую часть фрезы от рукоятки. Длина рабочей части фрезы 10 мм. Головка фрезы диаметром 3,5 мм заканчивается иглой диаметром 0,5 мм и длиной 2 мм. В спектрально чистых угольных стержнях длиной 10 мм фрезой высверливают проходной канал разного диаметра в соответствии с формой фрезы. Полученный таким образом угольный электрод представляет собой полый цилиндр, на противоположных концах которого отверстия имеют диаметр 3,5 и 0,5 мм. В отверстие большего диаметра электрода помещают навеску (10 мг) золы используемых проб, предварительно смешанную с порошком спектрально чистого угля в соотношении 1 : 1, и уплотняют угольным стержнем соответствующего диаметра. После этого электрод с пробой отверстием большего диаметра закрепляют на стержне соответствующего диаметра, изготовленном из спектрально чистого угля.

Верхний угольный электрод затачивают на конус. Во время работы спектрографа температура между угольными электродами выше 4000°С. По мере горения электродуги отверстие малого диаметра 8 нижнем электроде, через которое испаряется проба из кратера, постепенно увеличивается. Порошок из спектрально чистого угля, который служит основой кратера такого закрытого электрода,

предупреждает возможность сплавления пробы. Таким образом, обеспечивается полное сжигание пробы без потери анализируемого вещества.

Спектрография испытуемых проб производится в следующем порядке: шкала, железо, испытуемые пробы, стандарты, железо, шкала. Экспозиция для шкалы и железа равняется 20 с, для испытуемых проб и

стандарта — 2 мин. Испытуемые пробы подвергают спектрографии 2—3 раза, при расчетах пользуются средними данными. Спектры снимают на спектрографические фотопластинки для научных целей размером 9x12 см2, типа II, светочувствительность—11 единиц по ГОСТ 2814-50. После окончания съемки фотопластинку проявляют и закрепляют обычными методами (в качестве проявителя используют метол-гидрохинон, в качестве закрепителя — гипосульфит). В результате технической обработки на фотопластинке получают спектральные линии элементов, располагающихся в интервале длин волн 228,3— 500,0 нм. Полученные спектры расшифровывают путем сопоставления положения спектральных линий в испытуемых спектрограммах с положением линий известных длин волн в спектрограммах железа. Для облегчения расшифровки спектрограмм пользуются атласом дуговых спектров элементов С. К. Калинина с соавторами (1959). Определение линий испытуемых микроэлементов производят по характерным длинам волн всей серии, а фотометрию — по следующим: марганец — 280,1 нм, кремний—288,2 нм, алюминий — 308,2 нм, титан — 323,7 нм, медь — 327,4 нм. На этих длинах волн спектральные линии изучаемых элементов получаются наиболее интенсивными и удобными для исследования. Качественное определение микроэлементов производят с помощью спектрального микроскопа МИР-20 и спектроскопа ПС-18. Для количественного определения микроэлементов в испытуемых пробах готовят серию стандартов с содержанием испытуемых элементов в количествах 1, 0,1, 0,01,0,001 %.

Стандарты готовят на искусственной солевой основе, близкой по составу микроэлементов к испытуемой среде. Приготовление солевой основы и прибавление к ней различных элементов необходимо потому, что, по данным многих авторов, интенсивность спектральных линий зависит от сопутствующих элементов.

Состав солевой основы рассчитывают из среднего содержания микроэлементов в крови животных. Для приготовления 100 г солевой основы стандарта для крови берут: NaCl — 45,1 г, КН₂РО₄ — 52,5 г, СаО — 2 г, MgO — 0,4 г. Смесь тщательно растирают в агатовой ступке. После прибавления к солевой основе солей микроэлементов в соответствующих количествах стандарты также тщательно растирают в агатовой ступке и сохраняют в биксах с притертой пробкой. Все соли,

свинок.

Для проведения РИБТ необходимы: 1,2 мл 0,2 % раствора желатина, 2,8 мл 5 % раствора альбумина, 1,6 мл взвеси бледных трепонем; рН среды — 7,2. К указанной смеси прибавляют 0,15 мл комплемента (коктейль). Параллельно ставят две пробы: с активным (опыт) и реактивным (контроль) комплементами.

В меланжеры до отметки «1» набирают исследуемую сыворотку, а затем до отметки «2» — коктейль и закрывают их стерильным резиновым кольцом.

Одновременно аналогичную реакцию проводят с заведомо положительной и заведомо отрицательной сыворотками.

Меланжеры нумеруют и ставят в термостат при температуре 35 °С на 18—20 ч, после чего попарно (опыт — контроль) извлекают их из термостата и содержимое выливают в соответствующие пробирки. На предметное стекло наносят 2 капли: слева — опыт, справа — контроль, накрывают покровным стеклом и микроскопируют в темном поле зрения.

Вначале изучают результаты контроля: определяют процент подвижных и неподвижных бледных трепонем. Формула подсчета: X = (А — В)/А * 100, где А — количество подвижных бледных трепонем в контроле; В — количество подвижных бледных трепонем в опыте.

Пример: (24 — 19) / 24 * 100 = 21 %.

Оценки результатов РИБТ: ниже 20 % — отрицательный. 21—30 % — сомнительный, 31—50 % — слабоположительный, свыше 50 % —положительный.