6. Зниження продукції гліцерину з метою підвищення виходу етанолу у дріжджів Saccharomyces cerevisiae та Hansenula ploymorpha[34]

Розробка процесів конверсії низьковартісного гліцерину у більш цінний продукт є хорошою можливістю надання цінності продукції біодизелю. Було зроблено багато спроб для генетичної модифікації штамів S.cerevisiae для збільшення виходу етанолу. Етанол відіграє важливу роль у заміні обмежених в якості масел як цінний, відновлюваний альтернативний вид палива.

У попередніх дослідженнях S.cerevisiae були модифіковані шляхом метаболічної інженерії з метою покращення продукції етанолу з гліцерину [33]. Були надекспресовані гени ферментативних шляхів, продукти яких опосередковували перетворення гліцерину до гліколітичних інтермедіатів дигідроксиацетону та в подальшому дигідроксиацетон фосфату шляхом над експресії гліцерол дегідрогенази (Gcy) та дигідроксиацетон кінази (Dak). Однак, вихід етанолу лишався низьким, тому для подальшого покращення його виходу було вирішено знизити утворення побічного продукту, гліцерину, під час ферментації.

В процесі алкогольної ферментації гліцерин є основним побічним продуктом [13]. Гліцерин синтезується в S.cerevisiae у двох кроковому процесі, що включає в себе відновлення дигіроксиацетон фосфату (DHAP) НАД+-залежною гліцерол-3-фосфат дегідрогеназою (GPD) і супроводжується дефосфорилюванням гліцерол-3-фосфату (GPP)

ВСТАВИТИ КАРТИНКУ Fig 1.

Експорт гліцеролу з клітини частково контролюється FPS1, що кодує білок-переносник гліцеролу, що закривається під час гіпер осмотичного стресу. Зниження продукції гліцеролу та спрямування карбону до синтезу етанолу є важливим шляхом для покращення продукції етанолу. Для збільшення виходу етанолу ген FPS1 був підданий нокауту для запобігання виходу гліцерину з клітини. Делеція GPD2 у шляху синтезу гліцерину призводила до значного зниження утворення гліцерину, що, як наслідок, вело до збільшення виходу етанолу.

Гліцерин у клітині виконує функцію осмоліту, що збалансовує зовнішній осмотичний тиск. Осмоляльність всередині клітини регулюється активніше, ніж осмоляльність поза клітиною. Делеція FPS1 та GPD2 веде до зниження продукції гліцеролу і клітини стають високочутливими до осмотичного стресу [6]. Ген Gup1 та його гомолог ген Gup2 є членами суперсімейства мембрано-зв’язаних О-ацилтраснфераз. Gup1 є життєво важливим гліцерин-опосередкованого відновлення після солевого осмотичного стресу у мутантних штамів, що не здатні продукувати гліцерол під час росту в присутності малих кількостей останнього в середовищі, тим самим показуючи, що білок Gup1p може бути відповідальний за активність симпортера гліцерину [11].

У попередніх дослідженнях продукція етанолу S.cerevisiae була досягнута покращенням потоку атомів карбону до метаболіта-мішені. Були надекспресовані три гени для покращення продукції етанолу з використанням гліцерину як субстрату. Перші два ферменти, що кодуються генами Gcy та Dak , залучені у процеси конверсії гліцерину до дигідроксиацетону та дигідроксиацетон фосфату відповідно. Інший фермент, продукт гена Gup1 , що виконує роль у транспорті гліцеролу, також був надекспресований. Результати показали, що покращення виходу етанолу може бути досягнуте над експресією генів-утилізаторів гліцерину. Для подальшого покращення виходу етанолу в штамів з надекспресією генів Gup1, Gcy та Dak, було одночасно делеговано два гени: FPS1 та GPD2, що вело до зменшення виходу гліцеролу і покращення продукції етанолу. Отримані трансформанти показували високу чутливість до осмотичного стресу. Вихід етанолу у модифікованих штамів YPH499fps1Δgpd2Δ(pGcyaDak, pGupCas) складав 4,4 г/л. Дані результати демонструють можливість надання захисту від осмотичного стресу з одночанимс підвищенням виходу етанолу та зменшенням продукції гліцерину у штамах S.cerevisiae з використанням гліцерину як субстрату.

Відомо, що деякі неконвенційні дріжджі здатні рости на гліцерині і деякі з цих штамів мають здатність конвертувати його до етанолу. Співробітниками Інституту біології клітини запропоновано застосування підходів метаболічної інженерії для створення штамів H. polymorpha здатних до ефективної конверсії гліцерину до етанолу. Для цього буде посилено експресію генів PDC1, ADH1, GDH1, DAK1 таGUP1, а також делетовано ген GPD2. Заплановані оригінальні метаболічні заміни стимулюватимуть синтез етанолу з гліцерину.

Буде проведено скринінг наявних штамів дріжджів H. polymorpha на здатність до конверсії гліцерину в етанол. Будуть перевірені лінії CBS4732, NCYC495 та DL-1. Найкращі продуценти етанолу будуть використані як реципієнти для подальших експериментів. Буде проведено конструювання рекомбінантних векторів для посилення експресії генів PDC1 та ADH1, що кодують піруватдекарбоксилазу та алкогольдегідрогеназу. Відповідні конструкції буде введено в геном реципієнтних штамів. Селекціоновані штами буде стабілізовано. Буде визначено питомі активності Pdc1 та Adh1 та визначено ефективність конверсії гліцерину до етанолу.

На четвертому етапі проекту буде здійснено посилення експресії генів катаболізму гліцерину GDH1 таDAK1, що кодують гліцеролдегідрогеназу та дигідроксиацетонкіназу. Зазначені гени під контролем сильного конститутивного промотора у складі плазмід для мультикопійної інтеграції будуть введені в геном штамів, сконструйованих на попередньому етапі проекту. В селекціонованих штамів визначатиметься ефективність алкогольної ферментації гліцерину.

На заключному етапі буде сконструйовано делеційну касету для пошкодження гена GPD2, що кодує гліцеролфосфатдегідрогеназу. Гліцеролфосфатдегідрогеназа каталізує перетворення дигідроксиацетонфосфату в гліцерол-3-фосфат, а останній, в свою чергу, перетворюється в гліцерол за участі гліцеролфосфатази. Отже, делеція гена GPD2 буде обмежувати відтік вуглецю через синтез гліцерину, спрямовуючи вуглець до етанолу. Делеційну касету буде введено в геном штаму сконструйованого під час виконання попередніх етапів даного проекту. Також буде надекспресовано ген GUP1, що кодує транспортер гліцерину для полегшення транспорту субстрату в клітину. У сконструйованих штамів буде визначено ефективність алкогольної ферментації гліцерину при підвищеній температурі. Буде адаптовано умови культивування та ферментації, а також склад поживних середовищ для максимального збільшення виходу цільового продукту.

ВИСНОВОК

Отже, для покращення продукції гліцерину у наш час активно застосовуються методи мутагенезу, конструювання штамів або надекспресії генів, асоційованих з синтезом гліцерину. В даному рефераті описані стратегії покращення виходу гліцерину під час мікробної ферментації, які базуються на спрямуванні гліколітичного потоку на утворення гліцеролу та на зменшенні активності протікання процесів його дисиміляції.

З іншого боку, використання паливного етанолу є більш вигідним від активного використання сировини низької вартості, такої як чистий гліцерин. В дані реферативній роботі також описані сучасні методи метаболічної інженерії, що застосовуються для подальшого підвищення ефективного використання такими видами дріжджів, як Saccharomyces cerevisiae та Hansenula polymorpha гліцерину в якості сировини шляхом модифікації метаболічних шляхів. Одним з таких удосконаленням є зниження виходу гліцерину як побічного продукту метаболізму. Розглянені розроблені моделі шляхів, зфокусовані як на зниженні, так і на надпродукції гліцерину в дріжджів. Показані модифікації метаболічних шляхів для усунення гліцерину як побічного продукту з метою покращення синтезу етанолу як альтернативного вида палива.

ЛІТЕРАТУРА

1. "Viscosity of Glycerol and its Aqueous Solutions". Retrieved 2011-04-19.

2. Adler L, Blomberg A, Nilsson A. Glycerol metabolism and osmoregulation in the salt-tolerant yeast Debaryomyces hansenii. J Bacteriol 1985;162:300 – 6.

3. Albertyn J, Hohmann S, Thevelein JM, Prior BA. GPD1 encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase is essential for growth under osmotic stress in Saccharomyces cerevisiae and its expression is regulated by the highosmolarity glycerol response pathway. Mol Cell Biol 1994;14:4135 – 44.

4. Andre L, Hemming A, Adler L. Osmoregulation in Saccharomyces cerevisiae: studies on the osmotic induction of glycerol production and glycerol-3-phosphate dehydrogenase (NAD+). FEBS Lett 1991;286:13 – 7.

5. Approach. International Review of Chemical Engineering (I.Re.Che.), 1(6):571-580.

6. Beese, S.E., Negishi, T., Levin, D.E., 2009. Identification of positive regulators of the

7. Biodiesel 2020: Global Market Survey, Feedstock Trends and Market Forecasts.Biotechnol. 2, 173–180

8. Bisping B, Hecker R, Rehm HJ. Glycerol production by semicontinuous fed-batch fermentation with immobilized cells of Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol 1989;32:119 – 23.

9. Bisping B, Rehm HJ. Glycerol production by cells of Saccharomyces cerevisiae immobilized in sintered glass. Appl Microbiol Biotechnol 1986;23:174 – 9.

10. Blomberg A. Metabolic surprises in Saccharomyces cerevisiae during adaption to saline conditions: question, some answers and a model. FEMS Microbiol Lett 2000;182:1 – 8.

11. Bosson, R., Jaquenoud, M., Conzelmann, A., 2006. GUP1 of Saccharomyces cerevisiae encodes an O-acyltransferase involved in remodeling of the GPI anchor. Mol.Biol. Cell 17, 2636–2645.

12. Bryan Sims (2011-10-25). "Clearing the Way for Byproduct Quality: Why quality for glycerin is just as important for biodiesel". Biodiesel Magazine.

13. Choi, W.J., 2008. Glycerol-based biorefinery for fuels and chemicals. Recent Pat.

14. Compagno C, Boschi F, Ranzi BM. Glycerol production in a triose phosphate isomerase deficient mutant of Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Prog 1996;12:591 – 5.

15. Genbank Accession Numbers AJ251481, AB047394, AB047395

16. Larsson C, Pahlman I-L, Ansell R, Rigoulet M, Adler L, Gustafasson L. The importance of the glycerol-3-phosphate shuttle during aerobic growth of Saccharomyces cerevisiae. Yeast 1998;14:347 – 57.

17. Lide, D. R., ed. (1994). CRC Handbook of Data on Organic Compounds (3rd ed.). Boca Raton, FL: CRC Press. p. 4386.

18. Michnick S, Roustan IL, Remize F, Barre P, Dequin S. Modulation of glycerol and ethanol yields during alcoholic fermentation in Saccharomyces cerevisiae strains overexpressed or disrupted for GPD1 encoding glycerol 3- phosphate dehydrogenase. Yeast 1997;13:783 – 93.

19. Neuberg C, Hirsch J. U¨ber den Verlauf der alkoholischen-Garung bei alkalischer Reaktion: II. Garung mit lebender Hefe in alkalischen Lo¨sungen. Biochem Z 1919a;96:175 – 202.

20. Nevoigt E, Stahl U. Osmoregulation and glycerol metabolism in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol Rev 1997;21:231 – 41.

21. Nilles, Dave (2005). "A Glycerin Factor". Biodiesel Magazine.

22. Nilsson A, Adler L. Purification and characterization of glycerol-3-phosphate dehydrogenase (NAD+) in the salttolerant yeast Debaryomyces hansenii. Biochim Biophys Acta 1990;1034:180 – 5.

23. Norbeck J, Blomberg A. Metabolic and regulatory changes associated with growth of Saccharomyces cerevisiae in 1.4 M NaCl: evidence for osmotic induction of glycerol dissimilation via the dihydroxyacetone pathway. J Biol Chem 1997;272:5544 – 54.

24. Ohmiya R, Aiba H, Yamada H, Mizuno T. Clarification of the promoter structure of the osmoregulated gpd1+ gene encoding an isozyme of NADH-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase in fission yeast. Biosci Biotechnol Biochem 1997;61:553

25. Omori T, Takashita H, Omori N, Shimoda M Wang Z-X, Zhuge J. Cloning a gene encoding cytoplasmic glycerol-3-phosphate dehydrogenase from Candida glycerolgenesis. Acta Microbiol Sin 1999a;39:321.

26. Posada J.A., Orrego C.E., Cardona C.A. 2009. Biodiesel production: Biotechnological

27. Racenis PV, Lai JL, Das AK, Mullick PC, Hajra AK, Greenberg ML. The acyl dihydroxyacetone phosphate pathway enzymes for glycerolipid biosynthesis are present in the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol 1992;174:5702 – 10.

28. Sprague GF, Cronan JE. Isolation and characterization of Saccharomyces cerevisiae mutants defective in glycerolcatabolism. J Bacteriol 1977;129:1335 – 42.

29. van Zyl PJ, Kilian SG, Prior BA. The role of an active transport mechanism in glycerol accumulation duringosmoregulation by Zygosaccharomyces rouxii. Appl Microbiol Biotechnol 1990;34:231 – 5.

30. Wang H-T, Tahaim T, Robbins P, Yocum RR. Cloning, sequence, and disruption of the Saccharomyces diastaticus DARI gene encoding a glycerol-3-phosphate dehydrogenase. J Bacteriol 1994;176:7091 – 5.

31. Wang Z-X, Zhuge J, Cao Y, Chen J, Fang H-Y. The key enzymes of metabolism of glycerol in Candida glycerolgenesis. Acta Microbiol Sin 2000;40:180 – 7.

32. Worldwide review on biodiesel production. Austrian Biofuels Institute, www.biodiesel.at, 2003.

33. Yu, K.O., Kim, S.W., Han, S.O., 2010. Engineering of glycerol utilization pathway for ethanol production by Saccharomyces cerevisiae. Bioresour. Technol. 101,4157–4161.

34. Kyung Ok Yua, Seung Wook Kimb. Reduction of glycerol production to improve ethanol yield in an engineered Saccharomyces cerevisiae using glycerol as a substrate. Jour.of Biotech.2010.-209-214.

31