Ферменты – инструменты генетической инженерии
Успехи фундаментальных исследований в области структурной и функциональной молекулярной биологии и генетики создали надежный базис для развития моделирования природных процессов в условиях in vitro. В условиях in vivo инструментами молекулярного манипулирования являются ферменты. Технология рекомбинантной ДНК потому и называется технологией или генетической инженерией, что использует инструменты, обеспечивающие реализацию генетических процессов в природе. Никакие, даже самые мелкие микрохирургические инструменты не помогут при работе с макромолекулами ДНК и РНК. В роли "скальпеля", "ножниц" и "ниток для сшивания" выступают ферменты. Только они могут найти определенные последовательности нуклеотидов, "разрезать" молекулу или, наоборот, "заштопать" дырку в цепи ДНК. Эти ферменты созданы природой для живой клетки, в которой они выполняют работу по репликации ДНК при делении клетки, репарации, в процессах считывания и переноса генетической информации из клетки в клетку или в пределах клетки. Задача генного инженера или молекулярного биотехнолога - подобрать фермент, который выполнил бы поставленные задачи, то есть смог бы работать с определенным участком ДНК.
Следует отметить, что ферменты, применяемые в генетической инженерии, лишены видовой специфичности, поэтому экспериментатор может сочетать в единое целое фрагменты ДНК любого происхождения в избранной им последовательности. Это позволяет преодолевать установленные природой видовые барьеры и осуществлять межвидовое скрещивание.
Ферменты, применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК, можно объединить в несколько групп:
- ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (эндонуклеазы рестрикции или рестрицирующие эндонуклеазы);
- ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);
- ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);
- ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК.
Эндонуклеазы рестрикции
Основными ферментами, которые позволяют производить различные манипуляции с нуклеиновыми кислотами, являются нуклеазы – ферменты, гидролизующие фосфодиэфирную связь (фосфодиэстеразы). Нуклеазы специфическим образом модифицируют молекулы ДНК и РНК внутри (эндонуклеазы) и на концах (экзонуклеазы) полинуклеотидной цепи. Нуклеазы могут гидролизовать, т.е. разрушать, полинуклеотидную цепь с одной или другой стороны от фосфодиэфирного мостика. Каждый фермент проявляет определенную специфичность в этом отношении. Существуют, например нуклеазы, специфичные в отношении одноцепочечной ДНК: exo VII E.coli.; или нуклеазы, специфично расщепляющие РНК в комплексе ДНК-РНК: РНКазы Н.
Рестрицирующие эндонуклеазы (эндонуклеазы рестрикции, рестриктазы) - это ферменты, узнающие и гидролизующие определенные последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК (сайты рестрикции).
Еще в 1953 году было обнаружено, что ДНК определенного штамма E. coli, введенная в клетки другого штамма (например, ДНК штамма В - в клетки штамма С) не проявляет, как правило, генетической активности, так как быстро расщепляется на мелкие фрагменты. В 1966 году было показано, что это явление связано со специфической модификацией хозяйской ДНК - она содержит несколько метилированных оснований, отсутствующих в немодифицированной ДНК, причем метилирование (добавление к основанию метильной группы) происходит уже после завершения репликации. Бактерия способна отличить свою собственную ДНК от любой вторгающейся “чужеродной” именно по типу ее модификации. За “метку” отвечают метилирующие ферменты модификации, так называемые ДНК-метилазы. Различие в модификации делает чужеродную ДНК чувствительной к действию рестрицирующих ферментов, которые узнают отсутствие метильных групп в соответствующих сайтах.
Системы рестрикции (restriction – ограничение), т.е. ограничения действия чужеродного генетического материала, и модификации широко распространены у бактерий; их существование играет важную роль в защите резидентной ДНК от загрязнения последовательностями чужеродного происхождения.
Первая специфическая эндонуклаза была выделена Смитом и Вилькоксом из Hyamophilus influenzae (Hind III) в1970 году. А в 1978 году Вернер Арбур, Даниелс Натанс и Хамилтон Смит были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине “За обнаружение рестрикционных ферментов и их применение в молекулярной генетике”.
Поскольку разные бактерии по-разному метят свою ДНК, то и эндонуклеазы рестрикции должны узнавать разные последовательности. На настоящий момент описано приблизительно 500 эндонуклеаз рестрикции. Для всех этих ферментов обнаружено около 150 сайтов узнавания ДНК.
Номенклатура
Ферменты рестрикции-модификации именуются в соответствии с системой, предложенной в 1973 году Смитом и Натансом.
Название фермента начинается с трехбуквенного акронима, в котором первая буква совпадает с первой буквой названия рода, а остальные – с первыми двумя буквами вида организма, в котором данный фермент был обнаружен. Акроним пишется курсивом.
Дополнительные буквы служат для обозначения конкретного штамма или серотипа.
Римские цифры присваиваются в порядке обнаружения ферментов данного типа у конкретного организма. Дополнительные буквы и цифры курсивом не выделяются, но отделяются пробелом.
Например:
Bsu I – фермент первой системы рестрикции-модификации, обнаруженной у Bacillus subtilis
Eco R V – фермент пятой системы рестрикции-модификации, охарактеризованной у Escherichia coli штамма RY13.
В учебной и научной литературе наблюдаются значительные различия в написании названий одних и тех же ферментов рестрикции-модификации (в плане курсивного выделения и наличия пробелов). В связи с этим в 2003 году большая группа ученых предложила систематизировать классификацию и номенклатуру ферментов рестрикции-модификации.
Предложено отказаться от использования курсива.
Все название должно писаться без пробелов.
Рекомендовано избегать названий “рестриктаза” и “метилаза”, употребляя вместо этого “эндонуклеаза рестрикции” и “метилтрансфераза”.
В случае необходимости, тип ферментативной активности указывать буквами R (эндонуклеазная) и М (метилтрансферазная) перед акронимом – M.EcoRI и R.EcoRI
Ферментативная активность компонентов системы рестрикции-модификации
Эндонуклеазы рестрикции гидролизуют (расщепляют, разрезают, разрывают, рестрицируют) обе цепи ДНК. В зависимости от специфичности разрезания ДНК, образуются продукты, имеющие разное строение концов полинуклеотидных цепочек (рис.1).
Липкие концы имеют выступающие одноцепочечные участки. При этом выступающие участки двух образующихся фрагментов комплементарны друг другу. В силу продольной асимметричности молекулы ДНК, концы ее цепей (3’ и 5’) неравнозначны. Могут образовываться липкие концы с 5’-выступающими нуклеотидами (такие продукты образует эндонуклеаза рестрикции BamHI) и 3’-выступающие липкие концы, когда неспаренные нуклеотиды заканчиваются 3’-концом (такие продукты образует эндонуклеаза рестрикции AatII).
Рис. 1. Специфичность эндонуклеаз рекстрикции по типу образующихся при их действии концов фрагментов ДНК.
Липкие концы - BamHI и AatII; тупые концы – EcoRV
Тупые концы образуются в случае, когда разрезание ДНК происходит строго по оси симметрии узнаваемой последовательности (пример эндонуклеазы рестрикции с такой специфичностью – EcoRV.
Метилтрансферазы (класс трансфераз) систем рестрикции-модификации добавляют метильные группы к азотистым основаниям нуклеотидных остатков ДНК. Метилирование может проходить по позициям N5 и N6 в аденине, N4 и C5 – в цитозине. Единственный донор метильных групп для ДНК-метилтрансфераз – S-аденозилн-L-метионин.
В большинстве случает метилируется только одна цепь полуметилированной ДНК, полностью неметилированная ДНК расщепляется эндонуклеазной компонентой системы рестрикции модификации.
Классификация эндонуклеаз рестрикции
В настоящее время на основании субъединичной структуры, субстратной специфичности, потребности фермента в кофакторах и характера расщепления ДНК выделяют четыре типа систем рестрикции-модификации (I, II, III и IV).
Все эндонуклеазы рестрикции узнают на двуцепочечной ДНК строго специфические последовательности нуклеотидов, однако ферменты I-го типа осуществляют разрывы в произвольных точках молекулы ДНК, а ферменты II-го и III-го типов узнают и расщепляют ДНК в строго определенных точках внутри сайтов узнавания или на фиксированном от них расстоянии.
Ферменты типов I и III имеют сложную субъединичную структуру и обладают двумя видами активностей - модифицирующей (метилирующей) и АТФ-зависимой эндонуклеазной. Они нуждаются в ионах магния и S-аденозил-L-метионине в качестве кофакторов.
Эндонуклеазы системы типа IV расщепляют только модифицированную ДНК, имеющую в составе метилированные, гидроксиметилированные или гликозил-гидроксиметилированные основания. Для реакции с участием этих ферментов требуется гидролиз ГТФ. Эндонуклеазная и метилтрансферазная активности обеспечиваются одним полипептидом. Нуклеазная активность аллостерически активируется S-аденозил-L-метионином. Сайт рестрикции асимметричный, состоит из двух разнесенных частей. Разрезание ДНК происходит около одного из сайтов.
Эндонуклеазы рестрикции типа II
В системах рестрикции-модификации II-го типа нуклеазная и метилтрансферазная активности в большинстве случаев обеспечиваются независимыми белками. Рестрицирующие ферменты, входящие в системы этого типа, включают 11 подгрупп, которые отличаются, в основном, по структуре участка узнавания для фермента, а также по расположению позиции расщепления обеих нитей ДНК относительно узнаваемого сайта. Эндонуклеазы II-го типа разрезают ДНК в строго определенных позициях внутри или около сайта узнавания, в результате концы ДНК в месте разрыва имеют 3’-гидроксильные и 5’-фосфатные группы, способные к восстановлению фосфодиэфирных связей, т.е. к восстановлению полинуклеотидной цепочки в обеих нитях ДНК. Ввиду данных особенностей, эндонуклеазы этого типа особенно широко используются в генетической инженерии для получения рекомбинантных ДНК.
Для функционирования ферментов типа II не требуется АТФ или другие источники энергии. В системах рестрикции-модификации из разных источников активные нуклеазы могут существовать в виде мономера, гомодимера или гомотетрамера.
Большинство рестрицирующих эндонуклеаз класса II узнают последовательности, содержащие от 4 до 6 нуклеотидных пар, поэтому эти ферменты делят на мелко- и крупнощепящие. Мелкощепящие эндонуклеазы узнают тетрануклеотид и вносят в молекулы гораздо больше разрывов, чем крупнощепящие, узнающие последовательность из шести нуклеотидных пар. Это связано с тем, что вероятность встречаемости определенной последовательности из четырех нуклеотидов гораздо выше, чем последовательности из шести нуклеотидов. Например, в ДНК бактериофага Т7, состоящей из 40000 пар оснований, отсутствует последовательность, представляющая собой гексануклеотид GAATTC, который узнает фермент EcoRI (из Escherichia coli). Например, к мелкощепящим относятся эндонуклеазы HpaII (из Haemophilus parainfluenzae) и Alu (из Arthrobacter luteus), к крупнощепящим - EcoRI и HindIII (из Haemophilus influenzae). Если предположить, что участки узнавания эндонуклеаз рестрикции распределены вдоль цепи ДНК случайно, то мишень для ферментов, узнающих последовательность из четырех нуклеотидов, должна встречаться в среднем 1 раз через каждые 256 пар оснований, а для ферментов, узнающих шесть нуклеотидов, - через 4096 пар оснований.
Последовательности нуклеотидов двуцепочечной ДНК, узнаваемые эндонуклеазами рестрикции II типа (сайты рестрикции) часто представляют собой палиндромы. Точки узнавания рестриктазами симметричны относительно поворота на 180оС, то есть последовательность нуклеотидов слева направо в одной нити ДНК такая же, как справа налево в другой (рис. 2). Палиндромные участки узнавания и разрезания могут быть представлены также пятью парами, где средний нуклеотид может быть любым из четырех нуклеотидов (HinfI),
Рис. 2. Примеры палиндромных участков узнавания ДНК для эндонуклеаз рестрикции.
Расщепление происходит в фиксированном положении внутри сайта рестрикции или непосредственно вблизи него. При этом различные фрагменты вызывают образование как липких, так и тупых концов на фрагментах ДНК.
Эндонуклеазы рестрикции могут узнавать непалиндромные участки и разрезать ДНК на некотором расстоянии от них. В таких случаях образуются одноцепочечные выступащие концы длиной в один нуклеотид
MboII 5’– GGTGANNNNNNNN↓–
CCACTNNNNNNN↑ - 5’
Полностью метилированный сайт не подвержен ни рестрикции, ни модификации. Полуметилированный сайт не узнается ферментом рестрикции, но может быть превращен с помощью метилтрансферазы в полностью метилированный. У бактерий метилирование, как правило, связано с сохранением имеющегося состояния модификации. Репликация полностью метилированной ДНК ведет к образованию полуметилированной ДНК. Вероятно, узнавание полуметилированных сайтов представляет собой обычный этап функционирования метилтрансферазы in vivo. Неметилированный сайт-мишень представляет собой субстрат либо для рестрикции, либо для модификации in vitro. В клетке немодифицированная ДНК с большей вероятностью будет рестрицирована. Реакция разрезания осуществляется в две ступени. Сначала происходит гидролиз одной цепи ДНК, а затем – другой.
Среди пятисот рестрицирующих ферментов, выделенных из различных микроорганизмов, встречаются такие, которые узнают на ДНК одни и те же последовательности. Такие пары или группы называют изошизомерами. Первый выделенный фермент для узнавания и специфического разрезания заданной последовательности, называют прототипом, а все остальные подобные рестриктазы называют изошизомерами. Различают истинную изошизомерию: SphI (CGTAC↓G) и BbuI (CGTAC↓G), когда ферменты узнают и гидролизуют одну и ту же последовательность нуклеотидов ДНК в одних и тех же точках, и ложную,: XmaI (C↓CCGGG) и SmaI (CCC↓GGG), когда ферменты, узнавая один и тот же сайт на ДНК, производят разрывы в разных точках в пределах того же сайта. Совсем недавно предложено такие ферменты, как XmaI и SmaI, называть гетерошизомерами. Рестриктазы, разпознающие совершенно разные последовательности, но образующие одинаковые концы, называют изокаудомерами: MboI (↓GATC) и BamHI (G↓GATCC).
Физическое картирование ДНК по участкам узнавания эндонуклеаз рестрикции
Ферменты рестрикции стали эффективным инструментом исследования ДНК. Они позволяют превращать молекулы ДНК очень большого размера в набор фрагментов длиной от нескольких сотен до нескольких тысяч оснований. Обработка образца ДНК определенной эндонуклеазой рестрикции всегда дает один и тот же набор фрагментов — при условии, что расщепление происходит по всем сайтам узнавания. Если использовать несколько ферментов рестрикции и сначала обработать ДНК каждой из выбранных ферментов в отдельности, а затем их комбинациями, можно построить физическую карту данной ДНК, т. е. установить порядок расположения сайтов рестрикции вдоль молекулы. Определив размер полученных фрагментов с помощью гель-электрофореза, можно найти положение рестрикционных сайтов.
С помощью метода электрофореза в агарозном геле фрагменты ДНК, различающиеся по размеру, можно легко разделить, а затем исследовать каждый фрагмент отдельно (рис 3).
Рис. 3. Схема фракционирования фрагментов ДНК по размерам методом гельэлектрофореза
Короткие фрагменты мигрируют намного быстрее, чем длинные. При сравнительно высокой концентрации агарозы большие фрагменты вообще не могут проникнуть в гель. В процессе миграции рестрикционные фрагменты не деградируют, их можно элюировать (вымывать) в виде биологически активных двуцепочечных молекул. При окрашивании гелей красителями, связывающимися с ДНК, выявляется набор полос, каждая из которых отвечает рестрикционному фрагменту, молекулярную массу которого можно определить, проведя калибровку с помощью ДНК с известными молекулярными массами.
Пример. На рисунке 4А приведена схема распределения в геле фрагментов рестрикции и указаны размеры фрагментов, полученных в результате расщепления линейного участка какой-то условной ДНК эндонуклеазами ЭР1, ЭР2 и их смесью. Исходя из числа фрагментов ДНК, представленных на дорожках ЭР1 и ЭР2 видно, что данный участок ДНК имеет по два сайта рестрикции для каждой из них. Чтобы построить карту взаимного расположения этих сайтов на данном участке ДНК, следует сравнить размеры фрагментов, полученных при раздельной рестрикции и при рестрикции смесью ферментов. Результат такого сравнения представлен на рис. 4Б.
Если при гидролизе ДНК каждой из двух эндонуклеаз (ЭР1 и ЭР2) образуются три фрагмента, значит, в исходном фрагменте ДНК было два сайта узнавания для каждой из них. Фрагмент размером 300 п. н,, который образуется в результате гидролиза ЭР1, не расщепляется при гидролизе смесью ЭР1 и ЭР2 в отличие от ЭР1-фрагментов размером 850 и 500 п. н. Значит, два ЭР1-сайта находятся на расстоянии 300 п. н. друг от друга и между ними нет ЭР2-сайта, а в ЭР1-фрагментах длиной 850 и 500 п.н. есть по одному ЭР2-сайту. Фрагмент размером 950 п. н., который образуется при обработке ДНК рестриктазой ЭР2, при двойном гидролизе расщепляется ЭР1 на три фрагмента (250+300+400 - 900 п.н.). Значит, два ЭР2-сайта находятся на расстоянии 250 и 400 п. н. по разные стороны от сайтов для ЭР1. ЭР2 расщепляет ЭР1-фрагмент длиной 850 п. н. на фрагменты длиной 250 и 600 п, н., а один из сайтов для ЭР1 находится на расстоянии 250 п. н. от сайта для ЭР2, значит, фрагмент 600 п. н. должен содержать один из концов исходной молекулы ДНК. Далее, видно, что ЭР2 расщепляет ЭР1-фрагмент длиной 500 п. н. на два фрагмента размером 100 и 400 п. н. и что один из ЭР1-сайтов отделен от ЭР2-caйтa 400 п. н.; значит, фрагмент длиной 100 п. н, должен располагаться на другом конце исходной молекулы. Таким образом, на рисунке 4Б представлена физическая карта линейного участка условной ДНК по участкам рестрикции ЭР1 и ЭР2.
Рис. 4. Картирование сайтов рестрикции.
А Схема распределения фрагментов ДНК, полученных при гидролизе эндонуклеазами рестрикции. Очищенную ДНК гидролизовали рестриктазами ЭР1 и ЭР2 раздельно, а затем их смесью, проводили гель-электрофорез и визуализировали продукты окрашиванием бромистым этидиемРазмер фрагментов ДНК указан в парах нуклеотидов.
Б Рестрикционная карта, построенная по электрофоретическим данным.
Повторив подобные эксперименты на одной и той же ДНК, но с другими эндонуклеазами рестрикции, можно получить более подробную карту, где отмечено много сайтов рестрикции, а, значит, существует реальная возможность направленно работать с определенными участками молекул исследуемых ДНК. Таким образом, рестрикционные карты способствуют функциональному картированию ДНК
Располагая такой информацией, можно идентифицировать на ДНК биологически важные участки. Поскольку рестрикционная карта отражает расположение определенной последовательности нуклеотидов в данном участке, сравнение таких карт для двух или более родственных генов позволяет оценить гомологию между ними. Анализируя рестрикционные карты, можно сравнивать определенные участки ДНК разных видов животных без определения их нуклеотидной последовательности. Таким образом, например, было установлено, что хромосомные участки, кодирующие цепи гемоглобина у человека, орангутанга и шимпанзе сохранились в практически неизменном виде в течение последних 5 - 10 млн. лет (с тех пор как виды дивергировали).
Метод рестрикционного картирования позволяет увидеть крупные генетические изменения, такие как делеции или инсерции. При этом происходит уменьшение или увеличение рестрикционных фрагментов, а также исчезновение или возникновение сайтов рестрикции.
Один из приемов картирования – фингерпринт (“метод отпечатков пальцев” или DNA-fingerprint). Он подразумевает использование неупорядоченных и неполных наборов фрагментов, которые являются характеристикой генома, хотя описывает его не полностью.
Необходимо также отметить, что рестрикционный анализ ДНК и рестрикционные карты взаиморасположения сайтов узнавания и рестрикции для разных эндонуклеаз лежат в основе одного из самых распространенных методических подходов молекулярной генетики: исследование полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Этот вид анализа последовательностей ДНК используется как в фундаментальных исследованиях различных геномов так и для прикладных целей: например в ДНК-диагностике наследственных болезней человека.
И, наконец, расщепление рестрицирующими эндонуклеазами имеет еще одно применение. Когда два разных образца ДНК обрабатывают одной и той же эндонуклеазой рестрикции с образованием фрагментов с липкими концами, а затем смешивают эти образцы, то благодаря комплементарному спариванию липких концов фрагментов разных образцов могут образовываться новые комбинации генов - рекомбинантные ДНК (рис. 5).
Рис. 5. Применение эндонуклеазы рестрикции EcoRI для создания рекомбинантной ДНК
Следует отметить, что рекомбинантные ДНК можно получать также и при объединении фрагментов ДНК с тупыми концами, что будет рассмотрено в другом разделе пособия. Однако, для осуществления молекулярного клонирования недостаточно одних только ферментов рестрикции.
Фосфомоноэстеразы. Эти ферменты относятся к фосфатазам и отщепляют как 5’-, так и 3’-концевые фосфомоноэфирные группы в ДНК и РНК.
Полинуклеотидкиназа. Это еще один фермент, модифицирующий полинуклеотидные цепи. Он является фосфотрансферазой, которая специфически фосфорилирует 5’–концевые гидроксильные группы молекул ДНК и РНК. Полинуклеотидкиназу используют для получения радиоактивномеченых зондов. Фермент обеспечивает введение радиоактивной метки с 5’-конца полинуклеотидной цепи с помощью изотопа P32 в составе АТФ, меченой по γ–фосфату. Последовательное действие фосфатазы и полинуклеотидкиназы приводит к замещению немеченого 5’–концевого фосфомоноэфира на радиоактивный без каких-либо других изменений в цепи.
Лигазы
Лигазы (лат. ligare – сшивать, соединять) – это ферменты, катализирующие соединение двух молекул с образованием новой химической связи (лигирование). В молекулярной биологии лигазы разделяют на две большие группы: ДНК-лигазы и РНК-лигазы.
Рис. 6. Схема механизма действия ДНК-лигазы
ДНК-лигазы катализируют ковалентное сшивание цепей ДНК в дуплексе (рис. 6). Они образуют фосфодиэфирные мостики между 5’-фосфатной и 3’- гидроксильной группами соседних дезоксинуклеотидов в местах разрывов ДНК или между двумя молекулами ДНК. Для образования этих связей лигазы используют энергию гидролиза АТФ.
В 1961 г. Мезельсон и Вейгл на примере фага l показали, что рекомбинация включает разрыв и последующее воссоединение молекул ДНК. Это положило начало поискам фермента, участвующего в сшивании фрагментов ДНК. В 1967 году такой фермент был найден и получил название ДНК-лигаза. В биологических системах in vtvo ДНК-лигазы абсолютно необходимы в процессах репликации, репарации и рекомбинации.
В генной инженерии используют два типа ДНК-лигаз, отличающихся по потребностям в кофакторах и способу действия. ДНК-лигаза E. coli в качестве кофактора использует дифосфопиридиннуклеотид, а лигаза фага Т4 - АТФ в присутствии Mg2+. Лигаза фага Т4 более универсальна, так как помимо лигирования липких концов способна катализировать реакцию воссоединения двухцепочечных фрагментов ДНК с тупыми концами. Она используется чаще.