Цымбаленко Н.В.

Б И О Т Е Х Н О Л О Г И Я

Часть I

ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК

Учебное пособие

Печатается по решению кафедры зоологии Российского государственного педагогического университета имени А.И.Герцена

Цымбаленко Н.В. Биотехнология.Ч.1. Технология рекомбинантной ДНК: учебное пособие (для студентов биологических специальностей педагогических университетов), 2011 г.

Материал, представленный в данном учебном пособии, позволит обеспечить студентам биологических специальностей педагогических ВУЗов знакомство с современными методами технологии создания и применения рекомбинантных ДНК для фундаментальных и прикладных целей, а также поможет понять основные молекулярные принципы,на которых базируется биотехнология.

Объем и глубина излагаемого в пособии материала определяется учебными курсами по биотехнологии, которые с 2005 года автор пособия читает студентам факультета биологии РГПУ им А.И. Герцена.

Рецензенты:

Атаев Г.Л., заведующий кафедрой зоологии факультета биологии Российского государственного педагогического университета имени А.И.Герцена, доктор биологических наук, профессор (РГПУ)

Кириллова Н.В., заведующий кафедрой биохимии Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии, доктор биологических наук, профессор

СОДЕРЖАНИЕ

	Введение	5
1	Ферменты – инструменты генетической инженерии	10
.	Эндонуклеазы рестрикции Номенклатура Ферментативная активность компонентов системы рестрикции-модификации Липкие концы Тупые концы Классификация эндонуклеаз рестрикции Эндонуклеазы рестрикции типа II Физическое картирование ДНК по участкам узнавания эндонуклеаз рестрикции
	Фосфомоноэстеразы
	Полинуклеотидкиназа
	Лигазы
	Полимеразы
	ДНК-полимераза
	Обратная транскриптаза
	Терминальная трансфераза, поли-А - полимераза
2.	Способы объединения фрагментов ДНК	34
	Лигирование по одноименным "липким" концам
	Лигирование по одноименным "липким" концам с обработкой щелочной фосфатазой
	Лигирование по "тупым" концам
	Лигирование фрагментов с разноименными липкими, или липким и тупым концами
3.	Генетические векторы для клонирования ДНК	42
	Вставки ДНК
	Векторы для клонирования ДНК
	Плазмидные векторы Плазмидный вектор pBR322 Введение рекомбинантной ДНК в клетки бактерий и отбор трансформантов Другие плазмидные векторы
	Векторы на основе бактериофага λ
	Гибридные векторы
	Векторные системы для клонирования очень крупных фрагментов ДНК
	BAC-система
	YAC-векторы
4.	Вспомогательные методы технологии рекомбинантной ДНК	65
	Химический синтез ДНК
	Секвенирование ДНК
	Молекулярная гибридизация Гибридизация нуклиновых кислот в растворе Гибридизация нуклиновых кислот на твердых подложках Гибридизация на чипах
	Полимеразная цепная реакция Метод ПЦР ПЦР в реальном времени Обратная транскрипция, сопряженная с полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР)
	Направленный мутагенез
5.	Библиотеки генов	98
	Создание геномных библиотек. Скрининг с помощью ДНК-ДНК-гибридизации. Иммунологический скрининг. Скрининг по активности белка Клонирование структурных генов эукариот.
6.	Системы экспрессии чужеродных генов	108
	Экспрессия генов в клетках прокариот в составе плазмид
	Экспрессия генов, интегрированных в хромосомную ДНК прокариот
	Экспрессия рекомбинантных генов в эукариотических системах
	Экспрессирующие векторы для работы с клетками млекопитающих (ЭВМ)
7.	Химерные белки	117
	Репортерные гены
	Другие области применения “химерных белков”
	Повышение эффективности секреции
8.	Словарь терминов	122
9.	Список используемой литературы	138

ВВЕДЕНИЕ

Технология рекомбинантной ДНК (ее называют также молекулярным клонированием или генной инженерией) — это совокупность экспериментальных процедур, позволяющая осуществлять перенос генетического материала (дезоксирибонуклеиновой кислоты, ДНК) из одного организма в другой (Глик Б. и Пастернак Дж). Другими словами – это получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства. Речь идет о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.

Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу. Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК. С этого времени начинается интенсивное изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик, основываясь на многочисленном фактическом материале по химии нуклеиновых кислот и рентгеноструктурному анализу ДНК, создали двуспиральную модель структуры ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии.

На рубеже 50 - 60-х годов были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально. Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали E. coli, ее вирусы (бактериофаги) и плазмиды. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов. ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов. В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК. Таким образом, предпосылками к созданию технологии рекомбинантных ДНК послужили многие открытия в области молекулярной биологии, энзимологии нуклеиновых кислот и молекулярной генетики бактериальных вирусов и внехромосомных элементов бактерий (плазмид). Конструирование рекомбинантных молекул осуществляется с помощью целого арсенала ферментов — обязательного и незаменимого инструмента практически всех этапов этого сложнейшего процесса. Особая роль в развитии методов генной инженерии принадлежит рестрицирующим эндонуклеазам и ДНК-лигазам.

Технология рекомбинантной ДНК является важной составной частью биотехнологии. Поэтому ее часто называют молекулярной биотехнологией. Родившись в начале 70-х годов, она добилась сегодня больших успехов. Методы молекулярной биотехнологии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в "фабрики" для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств. В качестве примера можно привести биотехнологическое производство соматотропина.

Соматотропин - гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см. Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы. Компания "Genentec" (США) в 1980 году разработала технологию производства соматотропина с помощью бактерий, который был лишен перечисленных недостатков. В 1982 году гормон роста человека был получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции.

В 1978 году исследователи из компании "Genentec" впервые получили в специально сконструированном штамме кишечной палочки другой гормон – инсулин, а с 1984 года было начато промышленное производство этого необходимого медицинского препарата и в СССР. При производстве интерферона используют как E. coli, S. cerevisae (дрожжи), так и культуру фибробластов или трансформированных лейкоцитов. Аналогичными методами получают также безопасные и дешевые вакцины.

На технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями у разных организмов. ДНК-зонды также используют в диагностике различных заболеваний. Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход "белок-ген", получивший название "обратная генетика". При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Если он экспрессируется, несущая его клетка и ее потомки будут синтезировать измененный белок. Таким образом, открывается возможность “исправлять” дефектные гены и лечить наследственные заболевания.

Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенное яйцеклетку, могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие мутантный ген и передающие его потомкам. Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах. С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками. Например, микроинъекция рекомбинантной ДНК, содержавшей ген соматотропина быка, в зиготу кролика позволила получить трансгенное животное с гиперпродукцией этого гормона. Полученные животные обладали ярко выраженной акромегалией. В настоящее время даже трудно предсказать все возможности, которые будут реализованы в ближайшие несколько десятков лет.

Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека. Например, получение “биологических реакторов” - микроорганизмов, растений и животных, продуцирующих фармакологически значимые для человека вещества, создание сортов растений и пород животных с определёнными ценными для человека признаками. Методы генной инженерии позволяют провести генетическую паспортизацию,  диагностировать генетические заболевания,  создавать  ДНК-вакцины, проводить генотерапию различных заболеваний.

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:

• специфическое расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;

• быстрое секвенирование последовательности нуклеотидов очищенного фрагмента ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;

• конструирование рекомбинантной ДНК;

• гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью, основанную на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;

• клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;

• введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.

Однако, никакого единого, универсального набора методик здесь не существует, но чаще всего эксперименты с рекомбинантной ДНК проводят по следующей схеме:

• из организма — донора нужных генов — экстрагируют  нативную ДНК  (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чужеродная ДНК), подвергают ее ферментативному гидролизу (расщепляют, разрезают) и соединяют (лигируют, сшивают) с другой ДНК (вектор для клонирования, клонирующий вектор) с образованием новой, рекомбинантной молекулы (конструкция “клонирующий вектор—встроенная ДНК”);

• эту конструкцию вводят в клетку-хозяина (реципиент), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией;

• идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки);

• получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена.

.