10.3. Приготування поживних середовищ для культивування ізольованих клітин і тканин рослин

Мета роботи: ознайомитися з складом різних поживних середовищ і навчитися готувати одне з них.

Матеріали: склянки хімічні на 1 л – 4 шт., склянки з притертими пробками для зберігання маточних розчинів (на 1 л – 3 шт., на 100 мл – 1 шт.), скляні пляшечки з під пеніциліну (10 шт.), мірні піпетки на 10 і 1 мл, ваги технічні, ваги торсіонні або аналітичні, електроплитка.

Реактиви: набір розчинів кислот, солей, вітамінів, гормонів, вуглеводів.

Пояснення. Поживні середовища для культивування ізольованих клітин і тканин повинні включати всі необхідні рослинам макроелементи: азот, фосфор, калій, кальцій, сірку, магній, залізо; мікроелементи: бор, цинк, мідь, марганець та ін., а також вітаміни, вуглеводи, фітогормони. Деякі поживні середовища включають гідролізат казеїну, амінокислоти. Крім того, до складу поживних середовищ входить ЕДТА (етилендіамінтетраоцтової кислота) або її натрієва сіль, які покращують доступність заліза для клітин в широких межах рН.

Для отримання калюсних тканини в окремих випадках до поживного середовища додають рідкий ендосперм кокосового горіха (кокосове молоко), каштана та ін.

Вуглеводи є необхідним компонентом поживних середовищ для культивування ізольованих клітин і тканин, так як в більшості випадків останні не здатні до автотрофного харчування. Найчастіше в якості вуглеводу використовують сахарозу або глюкозу в концентрації 2…3%.

Обов’язковими компонентами поживних середовищ повинні бути ауксини, що викликають дедиференцировку клітин експлантів, і цитокініни, які індукують клітинні ділення. При зміні співвідношення між цими фітогормонами або при додаванні інших фітогормонів можуть бути викликані різні типи морфогенезу. На середовищах без гормонів ростуть пухлинні і «звиклі» тканини. Автономність по відношенню до обох гормонів або до одного з них пов’язана зі здатністю цих клітин продукувати гормони.

В якості ауксину в поживних середовищах використовують 2,4-діхлорфеноксіоцтову кислоту (2,4 Д), індолилоцтову кислоту (ІОК), α-наортілоцтову кислоту (НОК). ІОК майже в 30 разів менш активна, ніж 2,4 Д. Для індукції калюсу зазвичай необхідні високі концентрації ауксинів (частіше це 2,4 Д), при наступних пересадках їх зменшують.

В якості цитокінінів в штучних поживних середовищах використовують кинетін, 6-бензілалмінопурін (6-БАП), зеатін. Зеатін і 6-БАП у порівнянні з кинетіном більш активні щодо підтримки зростання ізольованих тканин і індукції органогенезу. До складу деяких поживних середовищ входить аденін.

Крім ауксинів і цитокінінів, окремі поживні середовища включають гибберелову кислоту (ГК). Присутність ГК в середовищі не є обов’язковим, але в деяких випадках вона стимулює ріст ізольованої тканини.

Тверді поживні середовища готують на агар-агарі. Він являє собою полісахарид, отриманий з морських водоростей. Найменшу кількість небажаних домішок містить бактеріальний агар (Bacto Agar або агар вітчизняного виробництва). Зазвичай до середовища додають 0,7% агару. У табл. 9 наведено склад найбільш поширених поживних середовищ.

Середа Мурасіге і Скуга – сама універсальна. Вона придатна для утворення калюсів, підтримання неорганізованого калюсного росту, індукції морфогенезу у більшості дводольних рослин.

Так, зміна співвідношення ауксину і кинетіну призводить до утворення або коренів (переважання ауксину), або стеблових культур (переважання кінетіна).

Середа Гамборга і Евелега добре підходить для культивування клітин і тканин бобових рослин і злаків, середа Уайта забезпечує вкорінення пагонів і нормальний ріст стебла після регенерації, а середа Нича і Нич придатна для індукції андрогенезу в культурі пиляків.

З метою економії часу розчини макросолей, мікросолей, вітамінів і фітогормонів готують концентрованими, що дозволяє їх багаторазово використовувати. Маткові розчини зберігають у холодильнику (причому для зберігання вітамінів потрібна негативна температура).