10. Клітинна інженерія рослин

Клітинна інженерія – це один з найбільш важливих напрямків в біотехнології. Вона заснована на використанні принципово нового об’єкта – ізольованої культури клітин або тканин еукаріотичних організмів, які здатні існувати та розмножуватися на штучному поживному середовищі (in vitro). Причому клітинна інженерія більшою мірою вивчає рослинні клітини і тканини, оскільки клітини рослин здатні до регенерації і володіють унікальною властивістю – тотипотентністю, тобто здатністю утворювати цілу рослин від однієї вихідної клітини. Крім того, кожна клітина рослини зберігає всі необхідні господарсько-корисні властивості материнського організму, в результаті чого всі штучно отримані особини є копією материнської.

На сучасному етапі склалися 3 основних напрямки клітинної інженерії рослин:

1. Оздоровлення та розмноження генетично цінних рослин, при якому при культивуванні in vitro переносники систем хвороб повністю усуваються, тому цей метод виявляється дуже зручними для швидкого розмноження і зберігання рослин, які були вражені захворюваннями, особливо вірусними. У цілому від однієї меристеми можна отримати сотні тисяч рослин на рік. Крім того, даний спосіб дозволяє значно скоротити період вегетативного розвитку культивованих рослин. Так, вегетаційний період груші в лабораторних умовах скоротився з 25 років до 4 років.

2. Отримання від культивованих калюсних тканин речовин вторинного синтезу, які використовуються в медицині, парфумерії, косметиці та інших галузях промисловості. Це алкалоїди, стероїди, глікозиди, гормони, ефірні олії та ін. Наприклад, для медицини отримують такі препарати, як болезаспокійлива речовина кодеїн з маку снодійного; дигоксин, тонізуючий серцеву діяльність – з наперстянки; стимулятор – кофеїн – з рослин чаю та кави; тонізуючі речовини – з клітин женьшеню та ін.

3. Кріозберігання диких видів рослин з метою забезпечення припливу генів диких рослин сільськогосподарським сортам, що селекціонуються.

Залежно від мети використання рослинних клітин і тканин застосовується два методу культивування:

1. вегетативне клонування рослин (метод мікророзмноження);

2. культивування калюсних тканин. Таким чином, роль культури клітин і тканин величезна, а способи їх культивування є потужним інструментом розширення можливостей селекційної роботи.

10.1. Метод вегетативного клонування рослин (клонального мікророзмноження)

Клональним мікророзмноженням називають нестатеве розмноження рослин за допомогою методу культури тканин, що дозволяє отримувати рослини, ідентичні вихідному. В основі отримання таких рослин лежить здатність соматичних клітин рослин повністю реалізовувати свій потенціал розвитку, тобто властивість тотипотентності.

Вегетативне клонування має істотні переваги перед традиційними способами розмноження:

1) високий коефіцієнт розмноження. Одна рослина при мікроклонірованіі може дати до 1 млн нових рослин в рік, тоді як при звичайних способах розмноження – тільки 50…100 рослин;

2) відсутність генетичної строкатості посадкового матеріалу, а отримання генетично однорідного масиву;

3) можливість оздоровлення рослин, звільнення їх від вірусів;

4) можливість розмноження рослин, які в природних умовах репродукуються з великими труднощами;

5) відтворення посадкового матеріалу круглий рік, що значно економить площі, що займають маточні рослини і рослини, що розмножують;

6) скорочення тривалості ювенільного періоду.

Однак було виявлено, що для більшості видів, в першу чергу для деревних порід, проблема вегетативного розмноження залишається до кінця не вирішеною. Так, не всі породи можуть розмножуватися даними способом (дуб, сосна, ялина, горіхоплідні тощо), і, крім того, практично неможливо за допомогою живцювання розмножувати багато видів деревних порід старше 10…15 років.

Процес вегетативного клонування включає наступні етапи:

1. вибір рослини-донора та ізолювання експлантів.

Експлант – це ізольований фрагмент тканини або органу рослини, що інкубується на поживному середовищі самостійно або використовується для отримання первинного калюсу. В цілому працювати можна з будь якою меристематичною тканиною, потенційно здатної сформуватися в рослину. Це може бути як сам зародок, так і кінчик основного пагона чи пазушних пагонів, що утворюються пізніше, а також тканини з різних органів рослини;

2) перенесення стерильного експланта на штучне живильне середовище;

3) підрощування стерильної культури;

4) перенесення проростків на середовище, що сприяє утворенню коренів.

Тривалість росту меристематичних тканин і формування первинних пагонів протягом перших чотирьох етапів становить 1…2 місяці;

5) дорощування на гідропонікі;

6) висадка в ґрунт. Найбільш сприятливий час для пересадки пробіркових рослин в ґрунт – весна або початок літа. Рослини повинні мати 2…3 листки і добре розвинену кореневу систему. Наприклад, щоб отримати рослини, вільні від вірусних хвороб, необхідно взяти маленький шматочок в 0,3…0,5 мм верхівкової тканини стебла, що складається з конуса наростання і 2…3 листових зачатків, оскільки було виявлено, що дана меристематична тканина не містить вірусів.

Необхідні умови роботи:

Дотримання суворої стерильності. Для цього органи рослин, з яких беруть експланти, миють щіткою в мильному розчині і споліскують дистильованою водою, після чого поміщають на кілька секунд у 70%-ний етанол. Після цього знову ретельно промивають дистильованою водою. Рослини, з яких збираються отримати культури тканин, вирощують в можливо більш чистому довкіллю, уникаючи надмірного поливу, забризкування листя. Зазвичай внутрішні тканини і серцевини цибулин, бульб і кореневищ є досить стерильними, тому що захищені верхніми шарами листя або лусочками. Тому структури, що покривають, спочатку протирають 70%-ним етанолом і обережно видаляють їх по одній, витягуючи потрібні для культивування тканини.

Стерилізацію експлантів більш відкритих органів і насіння проводять витримуванням протягом 5…20 хвилин в стерилізуючих розчинах (сулема, хлорамін, діацід, гіпохлорид та ін.) з наступним багаторазовим обмиванням стерильною водою. При необхідності використовують антибіотики (тетрациклін, бензилпеніцилін та ін.) в концентрації 100…200 мг/л. Поживні середовища стерилізують в автоклаві при температурі 120°С з тиском 0,175…1,0 атмосфери протягом 20 хвилин. Посуд загортають у фольгу або обгортковий папір і стерилізують сухим жаром в сушильній шафі при температурі 180°С протягом 4 годин.

Контроль якості поживних середовищ. Поживні середовища для культивування повинні містити основні поживні речовини, мікро- і макроелементи. Обов’язково контролюють наявність солей азоту, сахарози (не менше 3%), вітамінів, деяких амінокислот, факторів росту (ферменти і гормони). Крім того, істотне значення має стан середовища. Зазвичай поживне середовище роблять твердим, додаючи агар (0,7…1,0% маси до об’єму), однак для деяких рослин (суниця, вишня, чорна смородина, ананаси тощо) або на певних стадіях культивування переважно використовують рідкі середовища. Найчастіше використовують середовища Мурасіге і Скуга (1962), Нича і Уайта.

На перших трьох етапах, як правило, використовують середовище, що містить мінеральні солі за рецептом Мурасіге і Скуга, а також різні біологічно активні речовини та стимулятори росту (ауксини, цитокініни) в різних поєднаннях в залежності від об’єкта. У випадку, коли спостерігається інгібірування росту первинного експланту за рахунок виділення їм у поживне середовище токсичних речовин (фенолів, терпенів та ін.), посилити їх зростання можна, використовуючи антиоксиданти (аскорбінова кислота 1…60 мг/л), глютатіон (4…5 мг/л), полівінілпіролідон (5000…10000 мг/л) та ін.) У деяких випадках доцільно додавати у поживне середовище адсорбент – деревне активоване вугілля в концентрації 0,5…1,0%.

На четвертому етапі, домагаючись отримання максимальної кількості мериклонів, використовують середовища, що містять біологічно активні речовини, також регулятори росту. При цьому концентрація цитокінінів (БАП) повинна бути на рівні 1…10 мг/л, а ауксинів (ІОК і НОК) – до 0,5 мг/л.

На п’ятому етапі вегетативного клонування з метою укорінення рослин, а також адаптації їх до ґрунтових умов перед висадкою у ґрунт використовують середу Уайта, що містить в 2…4 рази менше мінеральних солей і цукрів (до 0,5…1,0%). Крім того, повністю виключається вміст цитокінінів. При пересадці рослин-регенерантів в субстрат (грунт) коріння відмивають від залишків поживного середовища і висаджують в ґрунтовий субстрат, попередньо простерилізований при 85…90°С протягом 1…2 годин.

Для більшості рослин в якості субстратів використовують торф, пісок (3:1); торф, дерновий грунт, перліт (1:1:1); торф, пісок, перліт (1:1:1).

Фізичні фактори. Для поліпшення вегетативного клонування фізичні фактори необхідно підбирати з урахуванням природного ареалу виростання культивованих рослин. У культуральній кімнаті повинні підтримуватися наступні параметри: освітленість – 1000…5000 люкс; вологість – 50…70%, температура повітря – 20 … 25°С протягом 14…16 годин на добу. Це можна забезпечити за допомогою кліматичних камер.