9.1. Іммобілізація клітин Рseudomonas fluorescens в гелі альгінат кальцію

Включення живих клітин вимагає м’яких умов іммобілізації, носій при цьому повинен являти собою систему відкритих пір з хорошими умовами для газообміну. Слід брати до уваги і можливий шкідливий вплив на життєздатність клітин агентів, що здійснюють зшивання. Найбільшого поширення набуло включення клітин в поліакріламідний гель і гель альгінату кальцію.

Альгінат – основний структурний полісахарид бурих морських водоростей. У присутності моновалентних катіонів полісахарид утворює в’язкий розчин, тоді як у присутності двовалентних катіонів, особливо кальцію, спостерігається утворення гелю. Оскільки гель утворюється в м’яких умовах, в ньому можна іммобілізувати живі клітини.

План роботи

1. Здійснити іммобілізацію клітин Pseudomonas fluorescens в гель альгінату кальцію.

2. Визначити ефективність роботи каталази, оксидази і нітратредуктази у іммобілізованих клітин.

Матеріал: культура бактерій Pseudomonas fluorescen, скляні піпетки, чашки Петрі, пробірки, пінцет

Реактиви: фізіологічний розчин, 4% розчин альгінату натрію, 0,2 М розчин CaCl₂ , 1% розчин DMPA, 1% розчин NaNO₃ або КNO₃, 3% розчин Н₂О₂, 1% реактив Грісса

Хід роботи:

Включення клітин Pseudomonas fluorescens в гель альгінату кальцію проводять за наступною методикою:

• 3 мл нічної культури бактерій Pseudomonas fluorescens центрифугують 5 хв. При 7000 об/хв і ресуспендують у фізіологічному розчині (1,5 мл);

• обережно змішують 1,5 мл клітинної суспензії з 1,5 мл 4% розчину альгінату натрію;

• за допомогою скляної піпетки (об’ємом 1-2 мл) отриману суміш скопують з висоти близько 20 см в чашку Петрі з 0,2 М розчином CaCl₂;

• залишають частинки альгінату кальцію з включеними в них клітинами в розчині CaCl₂ на 5 хв. для затвердіння.

Для визначення каталази кілька сферичних частинок з іммобілізованими клітинами за допомогою пінцета поміщають в пробірку з перекисом водню (3% розчин). Ефективність роботи каталази оцінюють за інтенсивністю утворення бульбашок водню.

Визначення оксидази здійснюють з 1% розчином N’N’-диметилпарафенілендиаміндигідрохлорида (DMPA). Кілька частинок з клітинами поміщають в пробірку з DMPA і витримують при перемішуванні (37°С) 15 хв. Про наявність оксидази буде свідчити фарбування розчину в рожевий колір.

Для визначення наявності нітратредуктази кілька частинок з клітинами поміщають в пробірку з 1 мл азотнокислого натрію або калію (1% розчин).

Пробірку інкубують при перемішуванні протягом 15 хв при 37°С. Потім у пробірку вносять 1 мл реактиву Грісса (1% розчин). Враховують реакцію на нітрити: протягом 3-5 хв. з’являється червоне забарвлення.

Питання для теоретичної підготовки

1. Охарактеризуйте способи іммобілізації клітин і ферментів.

2. Наведіть приклади успішного застосування іммобілізованих клітин і ферментів в практиці.

3. Опишіть переваги та недоліки іммобілізації клітин і ферментів в порівнянні з використанням бактеріальних культур і очищених ферментів.

Завдання 3

Відчутний внесок процеси іммобілізації ферментів і клітин внесли в тонкий органічний синтез, в аналіз, в медицину, в процеси конверсії енергії, в харчову та фармацевтичну промисловості. Вкажіть:

1. Загальні напрямки та досягнення застосування іммобілізованих ферментів у харчовій промисловості.

2. Загальні напрямки та досягнення застосування іммобілізованих ферментів в медицині.

3. Переваги іммобілізованих клітин перед іммобілізованими ферментами, перед вільними клітинами.

4. Які клітини підходять для іммобілізації? Одностадійні і поліферментні реакції.

5. Хімічні та фізичні методи іммобілізації клітин, можливості застосування.

Завдання 4.

Ферменти – речовини білкової природи і тому нестійкі при зберіганні. Крім того, ферменти не можуть бути використані багаторазово через труднощі у відділенні їх від реагентів і продуктів реакції. У 1916 році Дж.Нельсон і Е.Гріффін адсорбувати на вугіллі інвертазу і показали, що вона зберігає в такому вигляді каталітичну активність.

1. Винахід якого процесу впливу на ферменти з метою підвищення їх стійкості та можливості багаторазового застосування відбувся в 1916 р?

2. Переваги іммобілізованих ферментів перед нативними.

3. Основні вимоги до носіїв для отримання іммобілізованих ферментів.

4. Класифікація носіїв для отримання іммобілізованих ферментів.

5. Перерахуйте найбільш поширені носії з класу вуглеводів, відомі вам. Назвіть основні переваги і недоліки білків, при використанні їх в якості носіїв для іммобілізації ферментів.