6.2.6. Робота з оптичним мікроскопом
Оптичний мікроскоп (рис. 15) дає збільшення в десятки, сотні і навіть тисячі разів, що дозволяє безпосередньо спостерігати досліджувані об'єкти. Основні частини мікроскопа: оптична система, освітлювальна система, предметний столик і штатив. Оптична система складається з об'єктиву і окуляру, що з'єднані тубусом. На об'єктиві і окулярі вказується їх збільшення. Добуток цих збільшень дасть загальне збільшення мікроскопа. Освітлювальна система включає в себе джерело освітлення, двостороннє дзеркало (одна сторона плоска для природного освітлення, інша - увігнута для штучного освітлення) і конденсор з діафрагмою.
Рис. 15. Оптичний мікроскоп: 1 - дзеркало, 2 - конденсор, 3 - предметний столик, 4 - предметне скло, 5 - об'єктив, 6 - окуляр, 7 - тубус, 8 - макрометріческій гвинт, 9 - мікрометричний гвинт, 10 – штатив
На початку роботи домагаються правильного освітлення поля зору мікроскопа. При використанні зовнішнього освітлювача вихідний від нього пучок світла за допомогою увігнутого дзеркала направляють в наглядову систему мікроскопа. Діафрагма конденсора при цьому відкрита, а сам конденсор піднятий. При правильній установці освітлення поле зору мікроскопа має форму кола, добре і рівномірно освітленого. На предметний столик мікроскопа поміщають досліджуваний препарат і закріплюють його клемами. Попередній огляд препарату проводять при малому збільшенні (з об'єктивом х8).
Слід пам'ятати, що вільна робоча відстань (відстань між об'єктивом і сфокусованим препаратом) залежить від збільшення об'єктиву: для х8 це відстань 8 мм, для х40 - 0,6 мм, для х90 - 0,15 мм. Тому спочатку, спостерігаючи за об'єктивом збоку, за допомогою макрометричного гвинта опускають тубус мікроскопа і наближають об'єктив до препарату на відстань, меншу за робочу. Потім, дивлячись в окуляр, обертанням макрометричного гвинта піднімають тубус до появи в полі зору досліджуваного об'єкта. Далі за допомогою мікрометричного гвинта фокусують об'єкт, домагаючись чіткого зображення. Переміщенням конденсора і діафрагмою регулюють освітленість. Препарат досліджують по всій його поверхні, пересуваючи предметний столик бічними гвинтами. При переході до більшого збільшення (об'єктив х40) злегка відкривають діафрагму і мікрометричним гвинтом проводять фокусування.
Для мікроскопічного дослідження бактерій та внутрішньоклітинних структур користуються імерсійним об'єктивом. На досліджуваний препарат наноситься крапля імерсійної рідини, що має близький до скла показник заломлення. Імерсійний об'єктив (х90) за допомогою макрометричного гвинта занурюють в імерсійну рідину (кедрове масло), не торкаючись препарату. Потім, дивлячись в окуляр, тим же гвинтом дуже повільно піднімають тубус до появи зображення. Фокусують препарат мікрометричним гвинтом, який можна обережно обертати не більше ніж на половину обороту в ту або іншу сторону.
Після закінчення роботи слід підняти тубус мікроскопа, зняти препарат з предметного столика, привести в робоче положення об'єктив х8, видалити м'якою тканиною імерсійне масло з об'єктиву х90, відключити освітлювач і накрити мікроскоп поліетиленовим ковпаком.
Для підвищення контрастності нефарбованих прозорих живих об'єктів використовують мікроскопію у відбитому світлі, темнопольну мікроскопію і фазово-контрастну мікроскопію.
Темнопольна мікроскопія заснована на висвітленні об'єкта бічними променями світла, які не потрапляють в об'єктив. Спеціальний темнопольний конденсор має затемнену середню частину, що не проникна для центральних променів світла в об'єктив, тому поле зору виглядає абсолютно чорним. У площину препарату потрапляють тільки бічні промені, відбиті від дзеркальних поверхонь, розташованих всередині конденсора. Ці бічні промені освітлюють клітини, що містяться в препараті.
У результаті клітини мікроорганізмів у препараті "роздавлена крапля" будуть яскраво освітленими об'єктами на темному тлі. Для темнопольній мікроскопії потрібно більш потужне джерело світла, ніж для мікроскопії в світлому полі, товщина препарату повинна бути мінімальною, а предметні скла стандартної товщини (до 1,2 мм).
Препарат дріжджових клітин "роздавлена крапля" поміщають на предметний столик мікроскопа і фокусують при малому збільшенні (об'єктив х8) зі світлопольним конденсором. Потім замінюють конденсор на темнопольний. На лінзу конденсора наносять краплю імерсійного масла і піднімають конденсор до зіткнення краплі олії з предметним склом. Крапля повинна рівномірно заповнювати простір між лінзою конденсора і предметним склом і не містити бульбашок повітря. Переглядають препарат, користуючись об'єктивом х40.
Фазово-контрастна мікроскопія. У полі зору звичайного біологічного мікроскопа контрастними будуть об'єкти, які різною мірою поглинають світло у порівнянні з навколишнім середовищем. Оскільки при поглинанні світла відбувається зменшення амплітуди світла, що проходить, такі об'єкти називають амплітудними. Об'єкти, які поглинають світло, що проходить, в тій же мірі, що і навколишнє середовище, але відрізняються від неї значенням коефіцієнта заломлення, називають фазовими. При проходженні світла через такий об'єкт відбувається тільки зміна фази світлової хвилі, що проходить, за рахунок різниці в показниках заломлення. У фазово-контрастної мікроскопії методом інтерференційного контрастування перетворюють невидимі людському оку відмінності по фазі в зміни амплітуди світла. Інтерференційна мікроскопія робить можливим спостерігати без фарбування не тільки прозорі клітини живих мікроорганізмів, але і внутрішньоклітинні структури з різними показниками заломлення. У біологічних лабораторіях використовують для якісних та кількісних досліджень мікроорганізмів поляризаційно-інтерференційні мікроскопи.