6.2.2. Приготування постійних (фіксованих) препаратів

Приготування постійних препаратів мікроорганізмів починають з отримання мазка, для чого на поверхні предметного скла бактеріальної голкою розподіляють (розтирають) тонким шаром по площі 2...4 см² краплю суспензії досліджуваної культури. Занадто розтирати краплю не слід, тому що при цьому порушується природне взаєморозташування клітин мікроорганізмів. Мазок висушують на повітрі і фіксують. У процесі фіксації мікроорганізми гинуть і фіксуються на поверхні предметного скла, що захищає їх від змивання при фарбуванні. Крім того, убиті мікроорганізми краще сприймають барвники, ніж живі.

Фіксацію здійснюють фізичними і хімічними методами. У фізичному методі фіксація повністю висушеного мазка відбувається над полум'ям спиртівки протягом декількох секунд. Для цього кінець предметного скла мазком догори захоплюють за межі великим і вказівним пальцями і проводять скло 3...4 рази через верхню частину полум'я спиртівки. При термічній фіксації можливі незворотні зміни в будові клітини, тому фіксацію проводять швидко, не допускаючи перегріву предметного скла. Тим не менш, при вивченні будови клітини цей метод фіксації не використовують.

У хімічному методі фіксації предметне скло з мазком занурюють у фіксуючу рідину або наносять її на поверхню мазка. Час обробки залежить від використовуваного фіксатора: 10...15 хв. – етанол, спірто-ефірна (1:1) суміш, 5 хв. – ацетон, суміш Флемінга (75 см³ 1%- ї хромової кислоти, 20 см^з 2%-ї осмієвої кислоти і 5 см³ 75%-ї оцтової кислоти), 3 хв. – метанол, кілька секунд – формалін, пари осмієвої кислоти. Зазвичай при фіксації етанолом або спірто-ефірною сумішшю кілька крапель фіксатора піпеткою або з крапельниці наносять на поверхню препарату і залишають до повного випаровування фіксатора. Після фіксації препарат промивають водою і забарвлюють.

6.2.3. Фарбування препаратів

Забарвлення фіксованого препарату проводиться простими і складними методами. Простим методом забарвлення називають забарвлення препарату яким-небудь одним барвником. У складних методах фарбування проводять в декілька стадій різними барвниками. Складні методи забарвлення дозволяють вивчати структуру клітини і провести диференціацію мікроорганізмів.

У простих методах використовують барвники анілінового ряду (основні або кислотні). Для фарбування мікроорганізмів зазвичай використовують основні барвники (генціановий фіолетовий, кристалічний фіолетовий, метиленовий синій, основний фуксин), які більш інтенсивно їх фарбують у порівнянні з кислими барвниками (еритрозин, еозин, кислий фуксин). Барвники випускаються у вигляді аморфних або кристалічних порошків, з яких спочатку готують насичені спиртові розчини, а з них – ввідно-спиртові, які і використовують для фарбування.

Мікроорганізми фарбують, наносячи на певний час розчин барвника на поверхню фіксованого препарату. Наприклад, забарвлення основним фуксином ведуть 2 хв., метиленовим синім – 5...7 хв. Якщо необхідне тривале фарбування, то розчин барвника наливають у чашку Петрі, в неї поміщають предметні скла препаратами вниз на підкладені скляні палички і закривають кришкою. Після закінчення необхідного часу барвник зливають з предметного скла і промивають препарат водою до безбарвної промивної води, що стікає з поверхні скла. Потім препарат висушують на повітрі або обережно осушують фільтрувальним папером. Якщо препарат правильно пофарбований і добре промитий, то в полі зору мікроскопа він буде абсолютно прозорим з інтенсивно забарвленими клітинами.

Забарвлення за Грамом (модифікація Синьова). Згідно з методом, запропонованим Грамом в 1884 р, всі мікроорганізми поділяють на грампозитивні і грамнегативні. Забарвлення за цим методом проводять смужками фільтрувального паперу, попередньо просоченими 1%-м розчином генціанового, або кристалічного фіолетового і висушеними. На фіксований препарат накладають забарвлений папір і заливають невеликою кількістю води. Барвник розчиняється у воді і забарвлює при цьому препарат. Через 2 хв. папір видаляють пінцетом, зливають розчин барвника (але не змивають) і наносять розчин Люголя. Через 30-60 с після почорніння препарату розчин зливають, і предметне скло занурюють в етанол на 20...30 с. Знебарвлення спиртом здійснюють до зникнення фіолетових струменів фарби, після чого препарат ретельно промивають водою. Потім протягом 2 хв. забарвлюють препарат водним фуксином і промивають водою до знебарвлення промивної води.

Препарат висушують фільтрувальним папером. У грампозитивних мікроорганізмів комплекс йоду з основним фіолетовим барвником, що утворився в клітинній стінці при обробці спиртом, не вимивається і вони зберігають синьо-фіолетове забарвлення. Грамнегативні мікроорганізми при обробці спиртом знебарвлюються і легко забарвлюються фуксином в світло-червоний колір.

Дослідження мікрофлори молочних продуктів. Готують бактеріальної петлею мазки молочних продуктів (кефір, сметана, кисляк і т.і.) на предметних стеклах. Якщо досліджуваний продукт густий, то на скло попередньо наносять краплю стерильної води, в якій і розводять продукт. Мазок висушують при кімнатній температурі і фіксують спірто-ефірною сумішшю, для чого на мазок піпеткою наносять фіксатор на 5...7 хв. Спірто-ефірна суміш, крім фіксації, розчиняє жири, що заважають мікроскопічному дослідженню бактерій, що містяться в молочних продуктах. Фіксовані препарати забарвлюють метиленовим синім протягом 7...10 хв. Препарат підсушують і переглядають під мікроскопом з імерсійним об'єктивом (див. далі). Бактерії Streptococcus lactis (молочнокислі стрептококи) представляють собою кулясті клітини діаметром 0,5...1,0 мкм, розташовані попарно короткими або довгими ланцюжками. Бактерії Lactobacillus bulgaricus (болгарська ацидофілінова паличка) мають палочкоподібні клітини довжиною 4...5 мкм, розташовані окремо або короткими ланцюжками.

Забарвлення за методом Ціля-Нільсена застосовується для фарбування кислотостійких мікроорганізмів, які не офарблюються іншими методами, а також для виявлення спор. Для цього використовують контрастне фарбування, при якому спочатку повністю фарбують препарат, в тому числі і спори. Потім препарат частково знебарвлюють. При цьому спори, сильніше утримують барвник, залишаються пофарбованими, а цитоплазма знебарвлюється. Далі іншим барвником підфарбовують цитоплазму, створюючи колірний фон, на якому добре проглядаються пофарбовані в інший колір спори.

При фарбуванні за методом Ціля-Нільсена фіксований препарат покривають смужкою фільтрувального паперу, на яку наливають карболовий фуксин Ціля. Потім, тримаючи препарат пінцетом, нагрівають його над полум'ям спиртівки до появи парів. Додають нову порцію барвника і повторюють операцію протягом 3...5 хв. Далі видаляють фільтрувальний папір і охолоджують препарат до кімнатної температури, після чого ретельно промивають водою. Препарат знебарвлюють 5%-м розчином сірчаної кислоти, опускаючи предметне скло на 20...30 с в кислоту, і потім препарат ретельно промивають водою. Далі препарат протягом 5 хв. забарвлюють спіртоводним розчином метиленового синього, знову промивають водою і висушують. В результаті спори забарвлюються в червоний колір, а самі клітини в синій.

В одній з модифікацій цього методу на фіксований препарат наливають карболовий фуксин так, щоб весь мазок був покритий фарбою. Препарат повільно (2...5 хв.) нагрівають на полум'ї пальника до появи парів, при цьому фарбі не дають підсохнути, підливаючи нові порції фарби. Потім фарба змивається водою і знебарвлюється 95%-м етанолом, який містить 1 об. % концентрованої соляної кислоти. Препарат промивають водою і дофарбовують 3...5 хв. l%-м розчином метиленового синього.

Наявність спор в дріжджових клітинах можна встановити при розгляданні й незафарбованого препарату. При цьому вони будуть виглядати як сильно заломлюючі світло одноманітні за розмірами і формою (круглі або овальні) тільця, що містяться всередині клітин. При звичайних методах фарбування ці тільця залишаються незабарвленими.

Забарвлення за методом Віртца. Фіксований препарат дріжджових клітин заливають 5%-м водним розчином малахітового зеленого і 3...4 рази прогрівають над полум'ям спиртівки до появи парів (30...50 с). Фарбування можна робити, витримуючи препарат 3...5 хв. у розчині барвника при 80°С. Після фарбування препарати промивають водою і дофарбовують 30 с 0,5%-м водним розчином сафраніна. В результаті спори фарбуються в синьо-зелений, а клітини в червоний колір.

Фізіологічний стан дріжджових клітин при культивуванні на різних поживних середовищах можна оцінювати за наявністю включень волютину, глікогену і жиру. У молодих активно зростаючих дріжджових клітинах міститься багато волютину, який є не тільки резервною речовиною, але й бере участь у процесах спороутворення і вегетативного розмноження. Волютин зустрічається в клітинах у формі напіврідких зерен різної величини і складається з поліфосфатів, ліпопротеїдів, РНК та катіонів магнію. Накопичення волютину відбувається в середовищах, багатих сполуками фосфору. Глікоген – резервний полісахарид, масова частка якого в дріжджових клітинах може досягати в окремі періоди 30%. Жир також відноситься до резервних речовин. Включення жиру зустрічаються в клітинах багатьох мікроорганізмів, у тому числі і дріжджів. У цитоплазмі молодих дріжджових клітин включення жиру дуже дрібні, тоді як у більш зрілих і старих клітинах вони коалесцірують (злипаються) у великі краплі.

Фарбування включень волютину метиленовим синім. Фіксований препарат дріжджових клітин забарвлюють 3 хв. метиленовим синім і промивають водою. Зерна волютину при цьому забарвлюються у фіолетовий колір, а цитоплазма в блакитний. Для контрастування препарату або знебарвлюють цитоплазму обробкою 1%-м розчином сірчаної кислоти протягом 15...20 с з наступним швидким промиванням водою, або знебарвлюють зерна волютину обробкою 5%-м розчином соди.

Фарбування включень волютину за методом Омелянського. Фіксований препарат фарбують 30...60 с карболовим фуксином Ціля, промивають водою і занурюють на 20...30 с в 1%-й розчин сірчаної кислоти. Потім швидко промивають водою. Обробка кислотою знебарвлює цитоплазму, яку для контрастування додатково дофарбовували 15...30 с метиленовим синім (в розведенні 1:40). Після промивання водою препарат обережно підсушують фільтрувальним папером. Цитоплазма клітини забарвлюється в синій колір, а зерна волютину залишаються пофарбованими в червоний колір.

Фарбування включень глікогену. Включення глікогену забарвлюються розчином Люголя в червоно-бурий колір. На предметне скло наносять краплю суспензії дріжджових клітин. До краплі суспензії додають краплю розчину Люголя і накривають покривним склом.

Фарбування включень жиру. Для фарбування включень жиру використовують барвники, що розчиняються у жирі:

а) на фіксований препарат наносять краплю розчину судану III і накривають покривним склом. Включення жиру забарвлюються в червоний колір, а цитоплазма залишається безбарвною;

б) на предметне скло наносять краплю 40%-го розчину формаліну і вносять в неї бактеріальної петлею культуру дріжджів. Під дією формаліну клітини гинуть, і розпушується їх оболонка. Через 5 хв. до краплі інактивованої дріжджової суспензії додають крапельку розчину метиленового синього (1:40), витримують 10 хв. і додають краплю розчину судану ІІІ. Препарат накривають покривним склом і видаляють надлишок рідини фільтрувальним папером. Включення жиру забарвлюються в рожево-оранжевий колір, а цитоплазма в синій.