4.6. Вилучення генних продуктів у «брудній» суміші

Якщо ген вбудований в бактерію, то вона виробляє більше 2000 речовин і необхідно «виловити» потрібний білок (фермент, гормон) з «брудної» полімеризаційної суміші. Для цього використовують моноклональні антитіла, специфічні до даного білку.

Завдання 2

Генна інженерія з'явилася завдяки роботам багатьох дослідників у різних галузях біохімії та молекулярної генетики. Генна інженерія – сукупність методів, що дозволяють в пробірці переносити генетичну інформацію з одного організму в інший. Перенесення генів дає можливість долати міжвидові бар'єри і передавати окремі спадкові ознаки одних організмів іншим. Ціль - отримання клітин, здатних в промислових масштабах напрацьовувати деякі білки.

1. Що представляють із себе плазміди, їх роль в генній інженерії.

2. Для чого бактеріальні клітини виробляють рестріктази?

3. Сутність процесу клонування для отримання рекомбінантної ДНК із застосуванням плазмід та рестриктаз.

4. Основні продуценти, використовувані в побудові рекомбінантних білків.

5. Поняття вектора в генній інженерії.

Питання для самоперевірки

1. Які Вам відомі методи отримання генів?

2. Хімічний синтез гена. Хто і коли здійснив його вперше? Які відомі Вам гени синтезовані хімічно?

3. Рестрикційні нуклеази (рестріктази). Які організми їх містять і з якою метою?

4. Що таке «липкі кінці» і «тупі кінці» ДНК?

5. Метод «вистригання» генів, його недоліки.

6. Як здійснюється ферментативний синтез ДНК?

7. Хіміко-ферментативний синтез генів.

8. Охарактеризуйте олігонуклеотиди: лінкер, адаптери, праймери і промотори.

9. Які ферменти використовуються в генній інженерії?

10. У чому суть методу полімеразної ланцюгової реакції? Хто і коли її винайшов?

11. Що таке вектор? Що використовується в якості вектора?

12. Що таке маркерний ген (ген-репортер)?

13. Яким чином клонують гени?

14. Як отримують химерні вектори-косміди?

15. Які вектори використовують для переносу генів бактерій?

16. Навіщо потрібен ori-сайт в R-плазміди?

17. Як створені ВАС і VAC вектори і яка їхня нуклеотидная ємність?

18. Як здійснюється перенесення генів у клітини-реципієнти?

19. Якими прийомами підвищують проникність плазмолеми клітини-реципієнта?

20. Які існують методи трансформації рослинних клітин?

21. Якими методами визначають що ген донора вбудувався в клітини реципієнта?

22. Як здійснюється скринінг (відбір) трансформованих клітин або бактерій?

23. Які специфічні фрагменти повинен містити вектор, щоб вбудувати ген і він був здатним до експресії в реципієнтах (бактеріях, клітинах, організмах)?

24. Які вектори частіше використовуються для клонування генів тварин і способи їх введення в клітини тварин?

5. Методи виділення чистих культур мікроорганізмів

Сукупність життєздатних мікроорганізмів, вирощених на певному поживному середовищі, називається культурою мікроорганізмів, а сам процес вирощування - культивуванням. Чиста культура мікроорганізмів представляє собою популяцію мікроорганізмів одного виду, що виросла на стерильному поживному середовищі. Вид – таксономічна категорія, що об'єднує групу мікроорганізмів спільного походження, близьких за своїми властивостями, відокремлену відбором від інших видів і пристосовану до певної середовищі існування. Культуру, що складається з різних видів мікроорганізмів, називають змішаною культурою. У біотехнології застосовують високопродуктивні штами мікроорганізмів. Штамом називають чисту культуру мікроорганізмів, виділених з певного джерела, тобто з середовища їх проживання, і відрізняються деякими спадковими властивостями від інших представників виду. Штам являє собою генетично однорідну культуру, яку штучно підтримують за допомогою відбору спадково однорідних клітин.

У реальних умовах одночасно співіснують різні види мікроорганізмів. З природного середовища існування мікроорганізми переносяться в спеціальні середовища, умови в яких будуть сприятливі тільки для певного виду мікроорганізмів і несприятливі для супутніх видів. Такі поживні середовища називають елективними.

Елективні умови можна створювати, змінюючи склад середовища, значення рН, температуру і т.і. Наприклад, дріжджі виділяють, використовуючи кислі середовища (рН 3,5...5,0) або середовища, збагачені вуглеводами (масова частка цукрів 20...50%). У елективному поживному середовищі відбувається накопичення певного виду мікроорганізмів і пригничення життєдіяльності супутніх видів. Отримані культури називають накопичувальними.

З накопичувальної культури виділяють чисту культуру мікроорганізмів, використовуючи методи, що засновані або на біологічних властивостях мікроорганізмів, або на принципі механічного їх поділу. Практично виділення чистої культури зводиться до ізоляції однієї клітини і отримання чистої культури у вигляді потомства цієї батьківської клітини. Генетично однорідне потомство однієї клітини називається клоном. Таким чином, отримання чистої культури мікроорганізмів та її використання включає три етапи: отримання накопичувальної культури, виділення чистої культури і контроль чистоти культури.

Для придбання навичок роботи з мікроорганізмами використовуються окремі види дріжджів. Термін "дріжджі" не має самостійного таксономічного значення. Дріжджами називають грибні організми, які проводять більшу частину свого життєвого циклу у вигляді окремих клітин. Отже, дріжджі можуть бути визначені як одноклітинні гриби, що розмножуються брунькуванням або поділом. Однак, як представники вищих грибів, вони можуть утворювати міцелій і розмножуватися спорами, в тому числі і статевим способом.

Дріжджі більш зручний об'єкт для дослідження, ніж інші мікроорганізми. Клітини дріжджів досить великі, мають круглу, овальну або подовжену форму, з максимальними розмірами від декількох мікрометрів до 15-25 мкм і більше. Дріжджі не токсичні і не патогенні для людини і з найдавніших часів використовуються в якості біологічного агента для виробництва харчових продуктів.

Аскоспорогенні дріжджі, що входять до родини Saccharomyces (сахароміцети) і Schizosaccharomyces (шизосахароміцетів), широко використовуються в харчовій промисловості і, в якості продуцентів етанолу, в гідролізний промисловості та на сульфітно-спиртових заводах. Дріжджі, що відносяться до недосконалих грибів, серед яких виділяються представники роду Candida, використовують для виробництва білкової біомаси, так як в дріжджових клітинах міститься багато білка, вуглеводів, амінокислот і вітамінів групи В. Окремі види дріжджів вирощують не тільки на вуглеводному сировині, але і на вуглеводневому.